માયોસિન ભારે સાંકળની બહાર માનવ હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓની વિવિધતા

nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર. તમે જે બ્રાઉઝર વર્ઝનનો ઉપયોગ કરી રહ્યા છો તેમાં મર્યાદિત CSS સપોર્ટ છે. શ્રેષ્ઠ અનુભવ માટે, અમે નવીનતમ બ્રાઉઝર વર્ઝનનો ઉપયોગ કરવાની ભલામણ કરીએ છીએ (અથવા ઇન્ટરનેટ એક્સપ્લોરરમાં સુસંગતતા મોડને અક્ષમ કરો). વધુમાં, સતત સપોર્ટ સુનિશ્ચિત કરવા માટે, આ સાઇટ સ્ટાઇલ અને જાવાસ્ક્રિપ્ટથી મુક્ત રહેશે.
સ્કેલેટલ સ્નાયુ એક વિજાતીય પેશી છે જે મુખ્યત્વે માયોફિબ્રિલ્સથી બનેલી હોય છે, જે માનવોમાં સામાન્ય રીતે ત્રણ પ્રકારોમાં વર્ગીકૃત કરવામાં આવે છે: એક "ધીમો" (પ્રકાર 1) અને બે "ઝડપી" (પ્રકાર 2A અને 2X). જો કે, પરંપરાગત માયોફિબ્રિલ પ્રકારો વચ્ચે અને તેની અંદરની વિજાતીયતા હજુ સુધી નબળી રીતે સમજી શકાય છે. અમે માનવ વાસ્ટસ લેટરલિસમાંથી અનુક્રમે 1050 અને 1038 વ્યક્તિગત માયોફિબ્રિલ્સ પર ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક અને પ્રોટીઓમિક અભિગમો લાગુ કર્યા. પ્રોટીઓમિક અભ્યાસમાં પુરુષોનો સમાવેશ થતો હતો, અને ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક અભ્યાસમાં 10 પુરુષો અને 2 સ્ત્રીઓનો સમાવેશ થતો હતો. માયોસિન હેવી ચેઇન આઇસોફોર્મ્સ ઉપરાંત, અમે મેટાબોલિક પ્રોટીન, રિબોસોમલ પ્રોટીન અને સેલ્યુલર જંકશનલ પ્રોટીનને બહુપરીમાણીય ઇન્ટરમાયોફિબ્રિલ પરિવર્તનશીલતાના સ્ત્રોત તરીકે ઓળખ્યા. વધુમાં, ધીમા અને ઝડપી તંતુઓના ક્લસ્ટરોની ઓળખ હોવા છતાં, અમારા ડેટા સૂચવે છે કે પ્રકાર 2X તંતુઓ અન્ય ફાસ્ટ-ટ્વિચ તંતુઓથી ફેનોટાઇપિક રીતે અસ્પષ્ટ છે. વધુમાં, નેમાલાઇન માયોપેથીમાં માયોફાઇબર ફેનોટાઇપનું વર્ણન કરવા માટે માયોસિન હેવી ચેઇન-આધારિત વર્ગીકરણ અપૂરતું છે. એકંદરે, અમારા ડેટા બહુપરીમાણીય માયોફાઇબર વિજાતીયતા સૂચવે છે, જેમાં વિવિધતાના સ્ત્રોતો માયોસિન હેવી ચેઇન આઇસોફોર્મ્સથી આગળ વિસ્તરે છે.
સેલ્યુલર વિજાતીયતા એ બધી જૈવિક પ્રણાલીઓનું એક સહજ લક્ષણ છે, જે કોષોને પેશીઓ અને કોષોની વિવિધ જરૂરિયાતોને પૂર્ણ કરવા માટે વિશેષતા પ્રાપ્ત કરવાની મંજૂરી આપે છે.1 હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓની વિજાતીયતાનો પરંપરાગત દૃષ્ટિકોણ એ રહ્યો છે કે મોટર ચેતાકોષો મોટર એકમમાં ફાઇબર પ્રકારને વ્યાખ્યાયિત કરે છે, અને તે ફાઇબર પ્રકાર (એટલે ​​\u200b\u200bકે, માનવોમાં પ્રકાર 1, પ્રકાર 2A અને પ્રકાર 2X) માયોસિન હેવી ચેઇન (MYH) આઇસોફોર્મ્સની લાક્ષણિકતાઓ દ્વારા નક્કી થાય છે.2 આ શરૂઆતમાં તેમની pH ATPase અસ્થિરતા,3,4 અને પછીથી MYH ના તેમના પરમાણુ અભિવ્યક્તિ પર આધારિત હતું.5 જો કે, "મિશ્ર" તંતુઓની ઓળખ અને ત્યારબાદ સ્વીકૃતિ સાથે જે વિવિધ પ્રમાણમાં બહુવિધ MYH ને સહ-અભિવ્યક્ત કરે છે, હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓને અલગ ફાઇબર પ્રકારો તરીકે નહીં પણ સતત તરીકે જોવામાં આવે છે.6 આ હોવા છતાં, આ ક્ષેત્ર હજુ પણ માયોફાઇબર વર્ગીકરણ માટે પ્રાથમિક વર્ગીકરણ તરીકે MYH પર ખૂબ આધાર રાખે છે, એક દૃષ્ટિકોણ સંભવતઃ પ્રારંભિક ઉંદર અભ્યાસોની મર્યાદાઓ અને નોંધપાત્ર પૂર્વગ્રહોથી પ્રભાવિત છે જેમની MYH અભિવ્યક્તિ પ્રોફાઇલ્સ અને ફાઇબર પ્રકારોની શ્રેણી માનવોમાં અલગ હોય છે.2 પરિસ્થિતિ એ હકીકત દ્વારા વધુ જટિલ છે કે વિવિધ માનવ હાડપિંજરના સ્નાયુઓ એક વિવિધ પ્રકારના ફાઇબર.૭ વાસ્ટસ લેટરલિસ એક મિશ્ર સ્નાયુ છે જેમાં મધ્યવર્તી (અને તેથી પ્રતિનિધિત્વ કરે છે) MYH અભિવ્યક્તિ પ્રોફાઇલ છે.૭ વધુમાં, નમૂના લેવાની તેની સરળતા તેને માનવોમાં સૌથી વધુ અભ્યાસ કરાયેલ સ્નાયુ બનાવે છે.
આમ, શક્તિશાળી "ઓમિક્સ" સાધનોનો ઉપયોગ કરીને હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓની વિવિધતાની નિષ્પક્ષ તપાસ મહત્વપૂર્ણ છે પણ પડકારજનક પણ છે, જે અંશતઃ હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓની બહુ-ન્યુક્લિયેટેડ પ્રકૃતિને કારણે છે. જો કે, ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક્સ8,9 અને પ્રોટીઓમિક્સ10 ટેકનોલોજીઓએ તાજેતરના વર્ષોમાં વિવિધ તકનીકી પ્રગતિઓને કારણે સંવેદનશીલતામાં ક્રાંતિ લાવી છે, જેના કારણે સિંગલ-ફાઇબર રિઝોલ્યુશન પર હાડપિંજરના સ્નાયુનું વિશ્લેષણ શક્ય બન્યું છે. પરિણામે, સિંગલ-ફાઇબર વિવિધતા અને એટ્રોફિક ઉત્તેજના અને વૃદ્ધત્વ 11,12,13,14,15,16,17,18 પ્રત્યેના તેમના પ્રતિભાવને લાક્ષણિકતા આપવામાં નોંધપાત્ર પ્રગતિ થઈ છે. મહત્વપૂર્ણ રીતે, આ તકનીકી પ્રગતિઓમાં ક્લિનિકલ એપ્લિકેશનો છે, જે રોગ-સંકળાયેલ ડિસરેગ્યુલેશનનું વધુ વિગતવાર અને ચોક્કસ લાક્ષણિકતા આપવા માટે પરવાનગી આપે છે. ઉદાહરણ તરીકે, નેમાલાઇન માયોપથીનું પેથોફિઝિયોલોજી, સૌથી સામાન્ય વારસાગત સ્નાયુ રોગોમાંનું એક (MIM 605355 અને MIM 161800), જટિલ અને ગૂંચવણભર્યું છે.19,20 તેથી, હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓના ડિસરેગ્યુલેશનનું વધુ સારું લાક્ષણિકતા આ રોગની આપણી સમજણમાં નોંધપાત્ર પ્રગતિ તરફ દોરી શકે છે.
અમે માનવ બાયોપ્સી નમૂનાઓમાંથી મેન્યુઅલી અલગ કરાયેલા સિંગલ હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓના ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક અને પ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણ માટે પદ્ધતિઓ વિકસાવી અને તેમને હજારો તંતુઓ પર લાગુ કર્યા, જેનાથી અમને માનવ હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓની સેલ્યુલર વિજાતીયતાની તપાસ કરવાની મંજૂરી મળી. આ કાર્ય દરમિયાન, અમે સ્નાયુ તંતુઓના ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક અને પ્રોટીઓમિક ફેનોટાઇપિંગની શક્તિ દર્શાવી અને મેટાબોલિક, રિબોસોમલ અને સેલ્યુલર જંકશનલ પ્રોટીનને ઇન્ટરફાઇબર પરિવર્તનશીલતાના મહત્વપૂર્ણ સ્ત્રોત તરીકે ઓળખાવ્યા. વધુમાં, આ પ્રોટીઓમિક વર્કફ્લોનો ઉપયોગ કરીને, અમે સિંગલ હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓમાં નેમાટોડ માયોપથીની ક્લિનિકલ સુસંગતતા દર્શાવી, જે MYH પર આધારિત ફાઇબર પ્રકારથી સ્વતંત્ર બિન-ઓક્સિડેટીવ તંતુઓ તરફ સંકલિત પરિવર્તન દર્શાવે છે.
માનવ હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓની વિજાતીયતાની તપાસ કરવા માટે, અમે સિંગલ હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓના ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ અને પ્રોટીઓમ વિશ્લેષણને સક્ષમ કરવા માટે બે વર્કફ્લો વિકસાવી (આકૃતિ 1A અને પૂરક આકૃતિ 1A). અમે નમૂના સંગ્રહ અને RNA અને પ્રોટીન અખંડિતતાના જાળવણીથી લઈને દરેક અભિગમ માટે થ્રુપુટને ઑપ્ટિમાઇઝ કરવા સુધીના અનેક પદ્ધતિસરના પગલાં વિકસાવ્યા અને ઑપ્ટિમાઇઝ કર્યા. ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ વિશ્લેષણ માટે, રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શનના પ્રારંભિક પગલા પર નમૂના-વિશિષ્ટ મોલેક્યુલર બારકોડ દાખલ કરીને આ પ્રાપ્ત થયું, જેનાથી કાર્યક્ષમ ડાઉનસ્ટ્રીમ પ્રોસેસિંગ માટે 96 ફાઇબરને એકત્રિત કરવાની મંજૂરી મળી. પરંપરાગત સિંગલ-સેલ અભિગમોની તુલનામાં ઊંડા ક્રમ (±1 મિલિયન રીડ પ્રતિ ફાઇબર) એ ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ ડેટાને વધુ સમૃદ્ધ બનાવ્યો. 21 પ્રોટીઓમિક્સ માટે, અમે ઉચ્ચ થ્રુપુટ જાળવી રાખીને પ્રોટીઓમ ઊંડાઈને ઑપ્ટિમાઇઝ કરવા માટે timsTOF માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર પર DIA-PASEF ડેટા સંપાદન સાથે ટૂંકા ક્રોમેટોગ્રાફિક ગ્રેડિયન્ટ (21 મિનિટ) નો ઉપયોગ કર્યો. 22,23 સ્વસ્થ હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓની વિજાતીયતાની તપાસ કરવા માટે, અમે 14 સ્વસ્થ પુખ્ત દાતાઓમાંથી 1,050 વ્યક્તિગત તંતુઓના ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ્સ અને 5 સ્વસ્થ પુખ્ત દાતાઓમાંથી 1,038 તંતુઓના પ્રોટીઓમ્સનું વર્ણન કર્યું (પૂરક કોષ્ટક 1). આ પેપરમાં, આ ડેટાસેટ્સને અનુક્રમે 1,000-ફાઇબર ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ્સ અને પ્રોટીઓમ્સ તરીકે ઓળખવામાં આવે છે. અમારા અભિગમે 1,000-ફાઇબર ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક અને પ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણમાં કુલ 27,237 ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ્સ અને 2,983 પ્રોટીન શોધી કાઢ્યા (આકૃતિ 1A, પૂરક ડેટાસેટ્સ 1-2). 1,000 થી વધુ શોધાયેલા જનીનો અને ફાઇબર દીઠ 50% માન્ય મૂલ્યો માટે ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક અને પ્રોટીઓમિક ડેટાસેટ્સ ફિલ્ટર કર્યા પછી, અનુગામી બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ વિશ્લેષણ ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ અને પ્રોટીઓમમાં અનુક્રમે 925 અને 974 તંતુઓ માટે કરવામાં આવ્યા હતા. ફિલ્ટરિંગ પછી, પ્રતિ ફાઇબર સરેરાશ 4257 ± 1557 જનીનો અને 2015 ± 234 પ્રોટીન (સરેરાશ ± SD) શોધી કાઢવામાં આવ્યા હતા, જેમાં મર્યાદિત આંતર-વ્યક્તિગત પરિવર્તનશીલતા હતી (પૂરક આકૃતિઓ 1B–C, પૂરક ડેટાસેટ્સ 3–4). જોકે, સહભાગીઓમાં આંતરિક-વિષય પરિવર્તનશીલતા વધુ સ્પષ્ટ હતી, જે સંભવતઃ વિવિધ લંબાઈના તંતુઓ અને ક્રોસ-સેક્શનલ વિસ્તારો વચ્ચે RNA/પ્રોટીન ઉપજમાં તફાવતને કારણે હતી. મોટાભાગના પ્રોટીન (>2000) માટે, વિવિધતાનો ગુણાંક 20% થી નીચે હતો (પૂરક આકૃતિ 1D). બંને પદ્ધતિઓએ સ્નાયુ સંકોચન માટે મહત્વપૂર્ણ ઉચ્ચ વ્યક્ત હસ્તાક્ષરો (દા.ત., ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (પૂરક આકૃતિઓ 1E–F) સાથે ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ અને પ્રોટીનની વિશાળ ગતિશીલ શ્રેણીને કેપ્ચર કરવાની મંજૂરી આપી હતી. મોટાભાગની ઓળખાયેલી સુવિધાઓ ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક અને પ્રોટીઓમિક ડેટાસેટ્સ વચ્ચે સામાન્ય હતી (પૂરક આકૃતિ 1G), અને આ સુવિધાઓની સરેરાશ UMI/LFQ તીવ્રતા વાજબી રીતે સારી રીતે સહસંબંધિત હતી (r = 0.52) (પૂરક આકૃતિ 1H).
ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક્સ અને પ્રોટીઓમિક્સ વર્કફ્લો (BioRender.com સાથે બનાવેલ). MYH7, MYH2, અને MYH1 માટે BD ડાયનેમિક રેન્જ કર્વ્સ, અને ફાઇબર પ્રકાર સોંપણી માટે ગણતરી કરેલ થ્રેશોલ્ડ. E, F ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક્સ અને પ્રોટીઓમિક્સ ડેટાસેટ્સમાં ફાઇબરમાં MYH અભિવ્યક્તિનું વિતરણ. G, H યુનિફોર્મ ડાયવર્સિટી એપ્રોક્સિમેશન એન્ડ પ્રોજેક્શન (UMAP) MYH-આધારિત ફાઇબર પ્રકાર દ્વારા રંગીન ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક્સ અને પ્રોટીઓમિક્સ માટે પ્લોટ. I, J ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક્સ અને પ્રોટીઓમિક્સ ડેટાસેટ્સમાં MYH7, MYH2, અને MYH1 અભિવ્યક્તિ દર્શાવતા ફીચર પ્લોટ.
અમે શરૂઆતમાં ઓમિક્સ ડેટાસેટ્સમાં MYH અભિવ્યક્તિની ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા અને ગતિશીલ શ્રેણીનો લાભ લેતા ઑપ્ટિમાઇઝ્ડ અભિગમનો ઉપયોગ કરીને દરેક ફાઇબરને MYH-આધારિત ફાઇબર પ્રકાર સોંપવાનું નક્કી કર્યું. અગાઉના અભ્યાસોએ વિવિધ MYHs11,14,24 ની અભિવ્યક્તિની નિશ્ચિત ટકાવારીના આધારે ફાઇબરને શુદ્ધ પ્રકાર 1, પ્રકાર 2A, પ્રકાર 2X અથવા મિશ્ર તરીકે લેબલ કરવા માટે મનસ્વી થ્રેશોલ્ડનો ઉપયોગ કર્યો છે. અમે એક અલગ અભિગમનો ઉપયોગ કર્યો જેમાં દરેક ફાઇબરની અભિવ્યક્તિને MYHs દ્વારા ક્રમ આપવામાં આવ્યો હતો જેનો ઉપયોગ અમે ફાઇબર ટાઇપ કરવા માટે કર્યો હતો: MYH7, MYH2, અને MYH1, અનુક્રમે પ્રકાર 1, પ્રકાર 2A અને પ્રકાર 2X ફાઇબરને અનુરૂપ. ત્યારબાદ અમે ગાણિતિક રીતે દરેક પરિણામી વળાંકના નીચલા ઇન્ફ્લેક્શન બિંદુની ગણતરી કરી અને દરેક MYH માટે ફાઇબરને હકારાત્મક (થ્રેશોલ્ડ ઉપર) અથવા નકારાત્મક (થ્રેશોલ્ડ નીચે) તરીકે સોંપવા માટે તેનો ઉપયોગ થ્રેશોલ્ડ તરીકે કર્યો (આકૃતિ 1B–D). આ ડેટા દર્શાવે છે કે MYH7 (આકૃતિ 1B) અને MYH2 (આકૃતિ 1C) માં પ્રોટીન સ્તરની તુલનામાં RNA સ્તરે વધુ સ્પષ્ટ ઓન/ઓફ અભિવ્યક્તિ પ્રોફાઇલ્સ છે. ખરેખર, પ્રોટીન સ્તર પર, ખૂબ ઓછા તંતુઓ MYH7 વ્યક્ત કરતા નહોતા, અને કોઈ પણ ફાઇબરમાં 100% MYH2 અભિવ્યક્તિ નહોતી. અમે આગળ દરેક ડેટાસેટમાં બધા તંતુઓને MYH-આધારિત ફાઇબર પ્રકારો સોંપવા માટે પૂર્વનિર્ધારિત અભિવ્યક્તિ થ્રેશોલ્ડનો ઉપયોગ કર્યો. ઉદાહરણ તરીકે, MYH7+/MYH2-/MYH1- ફાઇબરને પ્રકાર 1 માટે સોંપવામાં આવ્યા હતા, જ્યારે MYH7-/MYH2+/MYH1+ ફાઇબરને મિશ્ર પ્રકાર 2A/2X માટે સોંપવામાં આવ્યા હતા (સંપૂર્ણ વર્ણન માટે પૂરક કોષ્ટક 2 જુઓ). બધા તંતુઓને એકત્રિત કરીને, અમે RNA (આકૃતિ 1E) અને પ્રોટીન (આકૃતિ 1F) બંને સ્તરો પર MYH-આધારિત ફાઇબર પ્રકારોનું નોંધપાત્ર રીતે સમાન વિતરણ જોયું, જ્યારે MYH-આધારિત ફાઇબર પ્રકારોની સંબંધિત રચના અપેક્ષા મુજબ વ્યક્તિઓમાં બદલાતી હતી (પૂરક આકૃતિ 2A). મોટાભાગના તંતુઓને શુદ્ધ પ્રકાર 1 (34–35%) અથવા પ્રકાર 2A (36–38%) તરીકે વર્ગીકૃત કરવામાં આવ્યા હતા, જોકે મિશ્ર પ્રકાર 2A/2X તંતુઓની નોંધપાત્ર સંખ્યા પણ મળી આવી હતી (16–19%). એક આશ્ચર્યજનક તફાવત એ છે કે શુદ્ધ પ્રકાર 2X તંતુઓ ફક્ત RNA સ્તરે જ શોધી શકાય છે, પરંતુ પ્રોટીન સ્તરે નહીં, જે સૂચવે છે કે ઝડપી MYH અભિવ્યક્તિ ઓછામાં ઓછી આંશિક રીતે પોસ્ટ-ટ્રાન્સક્રિપ્શનલી નિયંત્રિત થાય છે.
અમે એન્ટિબોડી-આધારિત ડોટ બ્લોટિંગનો ઉપયોગ કરીને અમારી પ્રોટીઓમિક્સ-આધારિત MYH ફાઇબર ટાઇપિંગ પદ્ધતિને માન્ય કરી, અને બંને પદ્ધતિઓએ શુદ્ધ પ્રકાર 1 અને પ્રકાર 2A ફાઇબરને ઓળખવામાં 100% સંમતિ પ્રાપ્ત કરી (પૂરક આકૃતિ 2B જુઓ). જો કે, પ્રોટીઓમિક્સ-આધારિત અભિગમ વધુ સંવેદનશીલ, મિશ્ર તંતુઓને ઓળખવામાં વધુ કાર્યક્ષમ હતો, અને દરેક ફાઇબરમાં દરેક MYH જનીનનું પ્રમાણ નક્કી કરવામાં વધુ કાર્યક્ષમ હતો. આ ડેટા હાડપિંજરના સ્નાયુ ફાઇબરના પ્રકારોને લાક્ષણિકતા આપવા માટે ઉદ્દેશ્ય, અત્યંત સંવેદનશીલ ઓમિક્સ-આધારિત અભિગમનો ઉપયોગ કરવાની અસરકારકતા દર્શાવે છે.
ત્યારબાદ અમે ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક્સ અને પ્રોટીઓમિક્સ દ્વારા પૂરી પાડવામાં આવેલી સંયુક્ત માહિતીનો ઉપયોગ માયોફાઇબર્સને તેમના સંપૂર્ણ ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ અથવા પ્રોટીઓમના આધારે ઉદ્દેશ્યથી વર્ગીકૃત કરવા માટે કર્યો. યુનિફોર્મ મેનીફોલ્ડ એપ્રોક્સિમેશન અને પ્રોજેક્શન (UMAP) પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને પરિમાણીયતાને છ મુખ્ય ઘટકો સુધી ઘટાડવા માટે, અમે ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ (આકૃતિ 1G) અને પ્રોટીઓમ (આકૃતિ 1H) માં માયોફાઇબર પરિવર્તનશીલતાને કલ્પના કરવામાં સક્ષમ હતા. નોંધનીય રીતે, માયોફાઇબર્સને સહભાગીઓ (પૂરક આકૃતિ 3C–D) અથવા પરીક્ષણ દિવસો (પૂરક આકૃતિ 3E) દ્વારા ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક્સ અથવા પ્રોટીઓમિક્સ ડેટાસેટ્સમાં જૂથબદ્ધ કરવામાં આવ્યા ન હતા, જે સૂચવે છે કે હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓમાં વિષયની અંદરની પરિવર્તનશીલતા વિષયની વચ્ચેની પરિવર્તનશીલતા કરતા વધારે છે. UMAP પ્લોટમાં, "ઝડપી" અને "ધીમા" માયોફાઇબરનું પ્રતિનિધિત્વ કરતા બે અલગ ક્લસ્ટરો ઉભરી આવ્યા (આકૃતિ 1G–H). MYH7+ (ધીમા) માયોફાઇબર UMAP1 ના ધન ધ્રુવ પર ક્લસ્ટર કરવામાં આવ્યા હતા, જ્યારે MYH2+ અને MYH1+ (ઝડપી) માયોફાઇબર UMAP1 ના નકારાત્મક ધ્રુવ પર ક્લસ્ટર કરવામાં આવ્યા હતા (આકૃતિઓ 1I–J). જોકે, MYH અભિવ્યક્તિના આધારે ફાસ્ટ-ટ્વિચ ફાઇબર પ્રકારો (એટલે ​​કે, પ્રકાર 2A, પ્રકાર 2X, અથવા મિશ્ર 2A/2X) વચ્ચે કોઈ તફાવત કરવામાં આવ્યો ન હતો, જે સૂચવે છે કે MYH1 (આકૃતિ 1I–J) અથવા અન્ય ક્લાસિકલ 2X માયોફાઇબર માર્કર્સ જેમ કે ACTN3 અથવા MYLK2 (પૂરક આકૃતિઓ 4A–B) અભિવ્યક્તિ સમગ્ર ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ અથવા પ્રોટીઓમને ધ્યાનમાં લેતી વખતે વિવિધ માયોફાઇબર પ્રકારો વચ્ચે તફાવત કરતી નથી. વધુમાં, MYH2 અને MYH7 ની તુલનામાં, થોડા ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ અથવા પ્રોટીન MYH1 (પૂરક આકૃતિઓ 4C–H) સાથે હકારાત્મક રીતે સંકળાયેલા હતા, જે સૂચવે છે કે MYH1 ની વિપુલતા માયોફાઇબર ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ/પ્રોટીઓમને સંપૂર્ણપણે પ્રતિબિંબિત કરતી નથી. UMAP સ્તરે ત્રણ MYH આઇસોફોર્મ્સની મિશ્ર અભિવ્યક્તિનું મૂલ્યાંકન કરતી વખતે સમાન નિષ્કર્ષ પર પહોંચ્યા હતા (પૂરક આકૃતિઓ 4I–J). આમ, જ્યારે 2X ફાઇબરને ફક્ત MYH ક્વોન્ટિફિકેશનના આધારે ટ્રાન્સક્રિપ્ટ સ્તરે ઓળખી શકાય છે, ત્યારે સમગ્ર ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ અથવા પ્રોટીઓમને ધ્યાનમાં લેતી વખતે MYH1+ ફાઇબર અન્ય ઝડપી ફાઇબરથી અલગ પાડી શકાતા નથી.
MYH ઉપરાંત ધીમા ફાઇબર વિજાતીયતાના પ્રારંભિક સંશોધન તરીકે, અમે ચાર સ્થાપિત ધીમા ફાઇબર પ્રકાર-વિશિષ્ટ પ્રોટીનનું મૂલ્યાંકન કર્યું: TPM3, TNNT1, MYL3, અને ATP2A22. ધીમા ફાઇબર પેટાપ્રકારોએ ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક્સ (પૂરક આકૃતિ 5A) અને પ્રોટીઓમિક્સ (પૂરક આકૃતિ 5B) બંનેમાં MYH7 સાથે ઉચ્ચ, જોકે સંપૂર્ણ ન હોવા છતાં, પિયર્સન સહસંબંધ દર્શાવ્યા. ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક્સ (પૂરક આકૃતિ 5C) અને પ્રોટીઓમિક્સ (પૂરક આકૃતિ 5D) માં અનુક્રમે લગભગ 25% અને 33% ધીમા તંતુઓને શુદ્ધ ધીમા તંતુઓ તરીકે વર્ગીકૃત કરવામાં આવ્યા ન હતા. તેથી, બહુવિધ જનીન/પ્રોટીન પેટાપ્રકારો પર આધારિત ધીમા ફાઇબર વર્ગીકરણ વધારાની જટિલતા રજૂ કરે છે, ફાઇબર પ્રકાર-વિશિષ્ટ તરીકે જાણીતા પ્રોટીન માટે પણ. આ સૂચવે છે કે એક જનીન/પ્રોટીન પરિવારના આઇસોફોર્મ્સ પર આધારિત ફાઇબર વર્ગીકરણ હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓની સાચી વિજાતીયતાને પર્યાપ્ત રીતે પ્રતિબિંબિત કરી શકતું નથી.
સમગ્ર ઓમિક્સ મોડેલના સ્કેલ પર માનવ હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓની ફેનોટાઇપિક પરિવર્તનશીલતાનું વધુ અન્વેષણ કરવા માટે, અમે મુખ્ય ઘટક વિશ્લેષણ (PCA) (આકૃતિ 2A) નો ઉપયોગ કરીને ડેટાનો નિષ્પક્ષ પરિમાણીયતા ઘટાડો કર્યો. UMAP પ્લોટની જેમ, PCA સ્તરે સહભાગી કે પરીક્ષણ દિવસ બંનેએ ફાઇબર ક્લસ્ટરિંગને પ્રભાવિત કર્યું નહીં (પૂરક આકૃતિઓ 6A–C). બંને ડેટાસેટ્સમાં, MYH-આધારિત ફાઇબર પ્રકાર PC2 દ્વારા સમજાવવામાં આવ્યો હતો, જેમાં સ્લો-ટ્વિચ પ્રકાર 1 ફાઇબરનું ક્લસ્ટર અને ફાસ્ટ-ટ્વિચ પ્રકાર 2A, પ્રકાર 2X અને મિશ્ર 2A/2X ફાઇબર ધરાવતું બીજું ક્લસ્ટર દર્શાવવામાં આવ્યું હતું (આકૃતિ 2A). બંને ડેટાસેટ્સમાં, આ બે ક્લસ્ટર મિશ્ર પ્રકાર 1/2A ફાઇબરની થોડી સંખ્યા દ્વારા જોડાયેલા હતા. અપેક્ષા મુજબ, મુખ્ય PC ડ્રાઇવરોના વધુ પડતા પ્રતિનિધિત્વ વિશ્લેષણથી પુષ્ટિ મળી કે PC2 સંકોચનશીલ અને મેટાબોલિક હસ્તાક્ષરો દ્વારા સંચાલિત હતું (આકૃતિ 2B અને પૂરક આકૃતિઓ 6D–E, પૂરક ડેટાસેટ્સ 5–6). એકંદરે, MYH-આધારિત ફાઇબર પ્રકાર PC2 સાથે સતત ભિન્નતાને સમજાવવા માટે પૂરતો જણાયો, કહેવાતા 2X ફાઇબરના અપવાદ સિવાય જે ફાસ્ટ ક્લસ્ટરની અંદર ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમમાં વિતરિત કરવામાં આવ્યા હતા.
A. MYH ના આધારે ફાઇબર પ્રકાર અનુસાર રંગીન ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ અને પ્રોટીઓમ ડેટાસેટ્સના મુખ્ય ઘટક વિશ્લેષણ (PCA) પ્લોટ. B. PC2 અને PC1 માં ટ્રાન્સક્રિપ્ટ અને પ્રોટીન ડ્રાઇવરોનું સંવર્ધન વિશ્લેષણ. ક્લસ્ટર પ્રોફાઇલર પેકેજ અને બેન્જામિન-હોચબર્ગ એડજસ્ટેડ p-મૂલ્યોનો ઉપયોગ કરીને આંકડાકીય વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. C, D. પ્રોટીઓમમાં ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ અને કોસ્ટામેર GO શબ્દોમાં ઇન્ટરસેલ્યુલર એડહેસન જનીન ઓન્ટોલોજી (GO) શબ્દો અનુસાર રંગીન PCA પ્લોટ. તીર ટ્રાન્સક્રિપ્ટ અને પ્રોટીન ડ્રાઇવરો અને તેમના દિશા નિર્દેશોનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે. E, F. યુનિફોર્મ મેનીફોલ્ડ અંદાજ અને પ્રક્ષેપણ (UMAP) ક્લિનિકલી સંબંધિત સુવિધાઓના પ્લોટ દર્શાવે છે જે ધીમા/ઝડપી ફાઇબર પ્રકારથી સ્વતંત્ર અભિવ્યક્તિ ગ્રેડિયન્ટ્સ દર્શાવે છે. G, H. ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ અને પ્રોટીઓમમાં PC2 અને PC1 ડ્રાઇવરો વચ્ચે સહસંબંધ.
અણધારી રીતે, MYH-આધારિત માયોફાઇબર પ્રકારે માત્ર બીજા ક્રમની સૌથી વધુ ડિગ્રી ચલનશીલતા (PC2) સમજાવી, જે સૂચવે છે કે MYH-આધારિત માયોફાઇબર પ્રકાર (PC1) થી સંબંધિત અન્ય જૈવિક પરિબળો હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓની વિજાતીયતાને નિયંત્રિત કરવામાં મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવે છે. PC1 માં ટોચના ડ્રાઇવરોના વધુ પડતા પ્રતિનિધિત્વ વિશ્લેષણથી જાણવા મળ્યું કે PC1 માં પરિવર્તનશીલતા મુખ્યત્વે ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમમાં કોષ-કોષ સંલગ્નતા અને રાઇબોઝોમ સામગ્રી દ્વારા નક્કી કરવામાં આવી હતી, અને પ્રોટીઓમમાં કોસ્ટામેર્સ અને રાઇબોસોમલ પ્રોટીન (આકૃતિ 2B અને પૂરક આકૃતિઓ 6D-E, પૂરક ડેટા સેટ 7). હાડપિંજરના સ્નાયુમાં, કોસ્ટામેર્સ Z-ડિસ્કને સાર્કોલેમા સાથે જોડે છે અને બળ ટ્રાન્સમિશન અને સિગ્નલિંગમાં સામેલ છે. 25 સેલ-કોષ સંલગ્નતા (ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ, આકૃતિ 2C) અને કોસ્ટામેર (પ્રોટીઓમ, આકૃતિ 2D) સુવિધાઓનો ઉપયોગ કરીને એનોટેટેડ PCA પ્લોટ્સે PC1 માં મજબૂત ડાબી શિફ્ટ જાહેર કરી, જે દર્શાવે છે કે આ સુવિધાઓ ચોક્કસ તંતુઓમાં સમૃદ્ધ છે.
UMAP સ્તરે માયોફાઇબર ક્લસ્ટરિંગની વધુ વિગતવાર તપાસમાં જાણવા મળ્યું કે મોટાભાગના લક્ષણો માયોફાઇબર સબક્લસ્ટર-વિશિષ્ટને બદલે માયોફાઇબર પ્રકાર-સ્વતંત્ર MYH-આધારિત અભિવ્યક્તિ ઢાળ દર્શાવે છે. આ સાતત્ય પેથોલોજીકલ પરિસ્થિતિઓ (આકૃતિ 2E) સાથે સંકળાયેલા ઘણા જનીનો માટે જોવા મળ્યું હતું, જેમ કે CHCHD10 (ન્યુરોમસ્ક્યુલર રોગ), SLIT3 (સ્નાયુ કૃશતા), CTDNEP1 (સ્નાયુ રોગ). આ સાતત્ય પ્રોટીઓમમાં પણ જોવા મળ્યું હતું, જેમાં ન્યુરોલોજીકલ ડિસઓર્ડર (UGDH), ઇન્સ્યુલિન સિગ્નલિંગ (PHIP), અને ટ્રાન્સક્રિપ્શન (HIST1H2AB) (આકૃતિ 2F) સાથે સંકળાયેલા પ્રોટીનનો સમાવેશ થાય છે. સામૂહિક રીતે, આ ડેટા વિવિધ માયોફાઇબર્સમાં ફાઇબર પ્રકાર-સ્વતંત્ર ધીમી/ઝડપી ટ્વિચ વિજાતીયતામાં સાતત્ય દર્શાવે છે.
રસપ્રદ વાત એ છે કે, PC2 માં ડ્રાઇવર જનીનોએ સારો ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ-પ્રોટીઓમ સહસંબંધ (r = 0.663) (આકૃતિ 2G) દર્શાવ્યો, જે સૂચવે છે કે ધીમા અને ઝડપી-ટ્વિચ ફાઇબર પ્રકારો, અને ખાસ કરીને હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓના સંકોચન અને મેટાબોલિક ગુણધર્મો, ટ્રાન્સક્રિપ્શનલી નિયંત્રિત છે. જો કે, PC1 માં ડ્રાઇવર જનીનોએ કોઈ ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ-પ્રોટીઓમ સહસંબંધ (r = -0.027) (આકૃતિ 2H) દર્શાવ્યો નથી, જે સૂચવે છે કે ધીમા/ઝડપી-ટ્વિચ ફાઇબર પ્રકારો સાથે અસંબંધિત ભિન્નતાઓ મોટાભાગે પોસ્ટ-ટ્રાન્સક્રિપ્શનલી નિયંત્રિત થાય છે. કારણ કે PC1 માં ભિન્નતા મુખ્યત્વે રિબોસોમલ જનીન ઓન્ટોલોજી શરતો દ્વારા સમજાવવામાં આવી હતી, અને પ્રોટીન અનુવાદમાં સક્રિય રીતે ભાગ લઈને અને પ્રભાવિત કરીને રિબોસોમ કોષમાં નિર્ણાયક અને વિશિષ્ટ ભૂમિકા ભજવે છે, 31 અમે આગળ આ અણધારી રિબોસોમલ વિજાતીયતાની તપાસ કરવા માટે નીકળી પડ્યા.
અમે સૌપ્રથમ GOCC શબ્દ "સાયટોપ્લાઝમિક રાઇબોઝોમ" (આકૃતિ 3A) માં પ્રોટીનની સંબંધિત વિપુલતા અનુસાર પ્રોટીઓમિક્સ મુખ્ય ઘટક વિશ્લેષણ પ્લોટને રંગ આપ્યો. જોકે આ શબ્દ PC1 ની હકારાત્મક બાજુએ સમૃદ્ધ છે, જેના પરિણામે એક નાનો ઢાળ આવે છે, રાઇબોસોમલ પ્રોટીન PC1 ની બંને દિશામાં પાર્ટીશન ચલાવે છે (આકૃતિ 3A). PC1 ની નકારાત્મક બાજુએ સમૃદ્ધ રિબોસોમલ પ્રોટીનમાં RPL18, RPS18, અને RPS13 (આકૃતિ 3B) શામેલ હતા, જ્યારે RPL31, RPL35, અને RPL38 (આકૃતિ 3C) PC1 ની હકારાત્મક બાજુ પર મુખ્ય ડ્રાઇવરો હતા. રસપ્રદ વાત એ છે કે, RPL38 અને RPS13 અન્ય પેશીઓની તુલનામાં હાડપિંજરના સ્નાયુમાં ખૂબ જ વ્યક્ત થયા હતા (પૂરક આકૃતિ 7A). PC1 માં આ વિશિષ્ટ રાઇબોસોમલ હસ્તાક્ષરો ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ (પૂરક આકૃતિ 7B) માં જોવા મળ્યા ન હતા, જે ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ પછીના નિયમન સૂચવે છે.
A. પ્રોટીઓમમાં સાયટોપ્લાઝમિક રાયબોસોમલ જનીન ઓન્ટોલોજી (GO) શરતો અનુસાર રંગીન મુખ્ય ઘટક વિશ્લેષણ (PCA) પ્લોટ. તીર PCA પ્લોટમાં પ્રોટીન-મધ્યસ્થી ભિન્નતાની દિશા દર્શાવે છે. રેખા લંબાઈ આપેલ પ્રોટીન માટે મુખ્ય ઘટક સ્કોરને અનુરૂપ છે. B, C. RPS13 અને RPL38 માટે PCA ફીચર પ્લોટ. D. સાયટોપ્લાઝમિક રાયબોસોમલ પ્રોટીનનું અનસપ્રવાઇઝ્ડ હાયરાર્કિકલ ક્લસ્ટરિંગ વિશ્લેષણ. E. 80S રાયબોસોમ (PDB: 4V6X) નું સ્ટ્રક્ચરલ મોડેલ જે હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓમાં વિવિધ વિપુલતાવાળા રાયબોસોમલ પ્રોટીનને હાઇલાઇટ કરે છે. F. mRNA એક્ઝિટ ચેનલની નજીક સ્થાનિક વિવિધ સ્ટોઇકિયોમેટ્રીવાળા રિબોસોમલ પ્રોટીન.
રિબોસોમલ વિજાતીયતા અને વિશેષતાના ખ્યાલો અગાઉ પ્રસ્તાવિત કરવામાં આવ્યા છે, જેમાં વિશિષ્ટ રિબોસોમલ ઉપ-વસ્તી (રિબોસોમલ વિજાતીયતા) ની હાજરી ચોક્કસ mRNA ટ્રાન્સક્રિપ્ટ પૂલ34 (રિબોસોમલ વિશેષતા) ના પસંદગીયુક્ત અનુવાદ દ્વારા વિવિધ પેશીઓ32 અને કોષો33 માં પ્રોટીન અનુવાદને સીધી રીતે પ્રભાવિત કરી શકે છે. હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓમાં સહ-અભિવ્યક્ત રિબોસોમલ પ્રોટીનની ઉપ-વસ્તીને ઓળખવા માટે, અમે પ્રોટીઓમમાં રિબોસોમલ પ્રોટીનનું એક અનસર્વિઝ્ડ હાયરાર્કિકલ ક્લસ્ટરિંગ વિશ્લેષણ કર્યું (આકૃતિ 3D, પૂરક ડેટા સેટ 8). અપેક્ષા મુજબ, રિબોસોમલ પ્રોટીન MYH ના આધારે ફાઇબર પ્રકાર દ્વારા ક્લસ્ટર થયા ન હતા. જો કે, અમે રિબોસોમલ પ્રોટીનના ત્રણ અલગ-અલગ ક્લસ્ટર ઓળખ્યા; પ્રથમ ક્લસ્ટર (રિબોસોમલ_ક્લસ્ટર_1) RPL38 સાથે સહ-નિયમિત છે અને તેથી પોઝિટિવ PC1 પ્રોફાઇલ સાથે ફાઇબરમાં અભિવ્યક્તિમાં વધારો થયો છે. બીજું ક્લસ્ટર (રિબોસોમલ_ક્લસ્ટર_2) RPS13 સાથે સહ-નિયમિત છે અને નકારાત્મક PC1 પ્રોફાઇલવાળા ફાઇબરમાં ઉન્નત છે. ત્રીજું ક્લસ્ટર (ribosomal_cluster_3) હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓમાં સંકલિત વિભેદક અભિવ્યક્તિ દર્શાવતું નથી અને તેને "મુખ્ય" હાડપિંજરના સ્નાયુ રિબોસોમલ પ્રોટીન ગણી શકાય. બંને રિબોસોમલ ક્લસ્ટર 1 અને 2 માં રિબોસોમલ પ્રોટીન હોય છે જે અગાઉ વૈકલ્પિક અનુવાદ (દા.ત., RPL10A, RPL38, RPS19, અને RPS25) ને નિયંત્રિત કરવા અને વિકાસને કાર્યાત્મક રીતે પ્રભાવિત કરવા માટે દર્શાવવામાં આવ્યા છે (દા.ત., RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 PCA પરિણામો સાથે સુસંગત, ફાઇબરમાં આ રિબોસોમલ પ્રોટીનનું અવલોકન કરાયેલ વિજાતીય પ્રતિનિધિત્વ પણ સાતત્ય દર્શાવે છે (પૂરક આકૃતિ 7C).
રાઇબોઝોમમાં વિજાતીય રાઇબોસોમલ પ્રોટીનના સ્થાનની કલ્પના કરવા માટે, અમે માનવ 80S રાઇબોઝોમ (પ્રોટીન ડેટા બેંક: 4V6X) (આકૃતિ 3E) ના માળખાકીય મોડેલનો ઉપયોગ કર્યો. વિવિધ રાઇબોસોમલ ક્લસ્ટરોથી જોડાયેલા રાઇબોસોમલ પ્રોટીનને અલગ કર્યા પછી, તેમના સ્થાનો નજીકથી ગોઠવાયેલા ન હતા, જે સૂચવે છે કે અમારો અભિગમ રાઇબોસોમના ચોક્કસ પ્રદેશો/અપૂર્ણાંકો માટે સંવર્ધન પ્રદાન કરવામાં નિષ્ફળ ગયો. રસપ્રદ વાત એ છે કે, ક્લસ્ટર 2 માં મોટા સબ્યુનિટ પ્રોટીનનું પ્રમાણ ક્લસ્ટર 1 અને 3 (પૂરક આકૃતિ 7D) કરતા ઓછું હતું. અમે જોયું કે હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓમાં બદલાયેલ સ્ટોઇકિયોમેટ્રીવાળા પ્રોટીન મુખ્યત્વે રાઇબોઝોમ સપાટી (આકૃતિ 3E) પર સ્થાનીકૃત હતા, જે વિવિધ mRNA વસ્તીમાં આંતરિક રાઇબોસોમ એન્ટ્રી સાઇટ (IRES) તત્વો સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરવાની તેમની ક્ષમતા સાથે સુસંગત હતા, જેનાથી પસંદગીયુક્ત અનુવાદનું સંકલન થતું હતું. 40, 41 વધુમાં, હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓમાં બદલાયેલ સ્ટોઇકિયોમેટ્રીવાળા ઘણા પ્રોટીન mRNA એક્ઝિટ ટનલ (આકૃતિ 3F) જેવા કાર્યાત્મક પ્રદેશોની નજીક સ્થિત હતા, જે ચોક્કસ પેપ્ટાઇડ્સના અનુવાદાત્મક વિસ્તરણ અને ધરપકડને પસંદગીયુક્ત રીતે નિયંત્રિત કરે છે. 42 સારાંશમાં, અમારા ડેટા સૂચવે છે કે હાડપિંજરના સ્નાયુ રિબોસોમલ પ્રોટીનની સ્ટોઇકિયોમેટ્રી વિજાતીયતા દર્શાવે છે, જેના પરિણામે હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓ વચ્ચે તફાવત જોવા મળે છે.
આગળ આપણે ફાસ્ટ- અને સ્લો-ટ્વિચ ફાઇબર સિગ્નેચર ઓળખવા અને તેમના ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ રેગ્યુલેશનની પદ્ધતિઓનું અન્વેષણ કરવા માટે નીકળી પડ્યા. બે ડેટાસેટ્સ (આકૃતિઓ 1G-H અને 4A-B) માં UMAP દ્વારા વ્યાખ્યાયિત ફાસ્ટ- અને સ્લો-ટ્વિચ ફાઇબર ક્લસ્ટર્સની તુલના કરીને, ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક અને પ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણમાં અનુક્રમે 1366 અને 804 વિભિન્ન રીતે વિપુલ પ્રમાણમાં સુવિધાઓ ઓળખવામાં આવી (આકૃતિઓ 4A-B, પૂરક ડેટાસેટ્સ 9-12). અમે સાર્કોમેર્સ (દા.ત., ટ્રોપોમાયોસિન અને ટ્રોપોનિન), ઉત્તેજના-સંકોચન જોડાણ (SERCA આઇસોફોર્મ્સ), અને ઊર્જા ચયાપચય (દા.ત., ALDOA અને CKB) સંબંધિત હસ્તાક્ષરોમાં અપેક્ષિત તફાવતોનું અવલોકન કર્યું. વધુમાં, પ્રોટીન યુબિક્વિટિનેશનનું નિયમન કરતી ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ અને પ્રોટીન ફાસ્ટ- અને સ્લો-ટ્વિચ ફાઇબર (દા.ત., USP54, SH3RF2, USP28, અને USP48) માં અલગ રીતે વ્યક્ત કરવામાં આવ્યા હતા (આકૃતિઓ 4A-B). વધુમાં, માઇક્રોબાયલ પ્રોટીન જનીન RP11-451G4.2 (DWORF), જે અગાઉ લેમ્બ સ્નાયુ ફાઇબર પ્રકારોમાં અલગ રીતે વ્યક્ત થતો હોવાનું દર્શાવવામાં આવ્યું છે43 અને કાર્ડિયાક સ્નાયુમાં SERCA પ્રવૃત્તિને વધારે છે44, ધીમા હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓમાં નોંધપાત્ર રીતે અપરેગ્યુલેટેડ હતું (આકૃતિ 4A). તેવી જ રીતે, વ્યક્તિગત ફાઇબર સ્તરે, ચયાપચય-સંબંધિત લેક્ટેટ ડિહાઇડ્રોજેનેઝ આઇસોફોર્મ્સ (LDHA અને LDHB, આકૃતિ 4C અને પૂરક આકૃતિ 8A)45,46 તેમજ અગાઉ અજાણ્યા ફાઇબર-પ્રકાર-વિશિષ્ટ સહીઓ (જેમ કે IRX3, USP54, USP28, અને DPYSL3) (આકૃતિ 4C) જેવા જાણીતા સહીઓમાં નોંધપાત્ર તફાવત જોવા મળ્યા હતા. ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક અને પ્રોટીઓમિક ડેટાસેટ્સ (પૂરક આકૃતિ 8B) વચ્ચે અલગ રીતે વ્યક્ત કરાયેલ સુવિધાઓનો નોંધપાત્ર ઓવરલેપ હતો, તેમજ ફોલ્ડ ચેન્જ સહસંબંધ મુખ્યત્વે સાર્કોમેર સુવિધાઓ (પૂરક આકૃતિ 8C) ની વધુ સ્પષ્ટ વિભેદક અભિવ્યક્તિ દ્વારા સંચાલિત હતો. નોંધપાત્ર રીતે, કેટલાક હસ્તાક્ષરો (દા.ત. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) ફક્ત પ્રોટીઓમિક સ્તરે જ મજબૂત પોસ્ટ-ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ નિયમન દર્શાવે છે અને તેમાં ધીમી/ઝડપી ટ્વિચ ફાઇબર પ્રકાર-વિશિષ્ટ અભિવ્યક્તિ પ્રોફાઇલ્સ હતી (પૂરક આકૃતિ 8C).
આકૃતિ 1G–H માં યુનિફોર્મ મેનીફોલ્ડ એપ્રોક્સિમેશન અને પ્રોજેક્શન (UMAP) પ્લોટ દ્વારા ઓળખાતા ધીમા અને ઝડપી ક્લસ્ટરોની તુલના કરતા A અને B જ્વાળામુખી પ્લોટ. રંગીન બિંદુઓ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ અથવા પ્રોટીનનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે જે FDR < 0.05 પર નોંધપાત્ર રીતે અલગ હોય છે, અને ઘાટા બિંદુઓ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ અથવા પ્રોટીનનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે જે લોગ ચેન્જ > 1 પર નોંધપાત્ર રીતે અલગ હોય છે. બે-માર્ગી આંકડાકીય વિશ્લેષણ બેન્જામિન-હોચબર્ગ એડજસ્ટેડ p મૂલ્યો (ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક્સ) સાથે DESeq2 વોલ્ડ પરીક્ષણનો ઉપયોગ કરીને અથવા પ્રયોગમૂલક બેયેશિયન વિશ્લેષણ સાથે લિમ્મા રેખીય મોડેલ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું, ત્યારબાદ બહુવિધ સરખામણીઓ (પ્રોટીઓમિક્સ) માટે બેન્જામિન-હોચબર્ગ એડજસ્ટમેન્ટ કરવામાં આવ્યું હતું. C ધીમા અને ઝડપી તંતુઓ વચ્ચે પસંદ કરેલા વિભેદક રીતે વ્યક્ત જનીનો અથવા પ્રોટીનના હસ્તાક્ષર પ્લોટ. D નોંધપાત્ર રીતે વિભિન્ન રીતે વ્યક્ત ટ્રાન્સક્રિપ્ટ અને પ્રોટીનનું સંવર્ધન વિશ્લેષણ. ઓવરલેપિંગ મૂલ્યો બંને ડેટાસેટ્સમાં સમૃદ્ધ થાય છે, ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ મૂલ્યો ફક્ત ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમમાં સમૃદ્ધ થાય છે, અને પ્રોટીઓમ મૂલ્યો ફક્ત પ્રોટીઓમમાં સમૃદ્ધ થાય છે. બેન્જામિન-હોચબર્ગ એડજસ્ટેડ p-મૂલ્યો સાથે ક્લસ્ટર પ્રોફાઇલર પેકેજનો ઉપયોગ કરીને આંકડાકીય વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. E. SCENIC દ્વારા ઓળખાયેલા ફાઇબર પ્રકાર-વિશિષ્ટ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળો, જે SCENIC-વ્યુત્પન્ન નિયમનકાર વિશિષ્ટતા સ્કોર્સ અને ફાઇબર પ્રકારો વચ્ચેના વિભેદક mRNA અભિવ્યક્તિના આધારે ઓળખાય છે. F. ધીમા અને ઝડપી તંતુઓ વચ્ચે વિભેદક રીતે વ્યક્ત કરાયેલા પસંદ કરેલા ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળોનું પ્રોફાઇલિંગ.
ત્યારબાદ અમે વિભિન્ન રીતે રજૂ કરાયેલા જનીનો અને પ્રોટીનનું વધુ પડતું પ્રતિનિધિત્વ વિશ્લેષણ કર્યું (આકૃતિ 4D, પૂરક ડેટા સેટ 13). બે ડેટાસેટ્સ વચ્ચે ભિન્નતા ધરાવતા લક્ષણો માટે પાથવે સંવર્ધનથી અપેક્ષિત તફાવતો જાહેર થયા, જેમ કે ફેટી એસિડ β-ઓક્સિડેશન અને કીટોન ચયાપચય પ્રક્રિયાઓ (ધીમા તંતુઓ), માયોફિલેમેન્ટ/સ્નાયુ સંકોચન (અનુક્રમે ઝડપી અને ધીમા તંતુઓ), અને કાર્બોહાઇડ્રેટ કેટાબોલિક પ્રક્રિયાઓ (ઝડપી તંતુઓ). ઝડપી તંતુઓમાં સેરીન/થ્રેઓનાઇન પ્રોટીન ફોસ્ફેટેઝ પ્રવૃત્તિ પણ વધી હતી, જે નિયમનકારી અને ઉત્પ્રેરક ફોસ્ફેટેઝ સબ્યુનિટ્સ (PPP3CB, PPP1R3D, અને PPP1R3A) જેવી સુવિધાઓ દ્વારા સંચાલિત હતી, જે ગ્લાયકોજેન ચયાપચયને નિયંત્રિત કરવા માટે જાણીતા છે (47) (પૂરક આકૃતિઓ 8D–E). ઝડપી તંતુઓથી સમૃદ્ધ થયેલા અન્ય માર્ગોમાં પ્રોટીઓમમાં પ્રોસેસિંગ (P-) બોડીઝ (YTHDF3, TRIM21, LSM2) (પૂરક આકૃતિ 8F), જે સંભવિત રીતે પોસ્ટ-ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ રેગ્યુલેશન (48) માં સામેલ છે, અને ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમમાં ટ્રાન્સક્રિપ્શન ફેક્ટર પ્રવૃત્તિ (SREBF1, RXRG, RORA) (પૂરક આકૃતિ 8G) શામેલ છે. ધીમા તંતુઓ ઓક્સિડોરેક્ટેઝ પ્રવૃત્તિ (BDH1, DCXR, TXN2) (પૂરક આકૃતિ 8H), એમાઇડ બાઇન્ડિંગ (CPTP, PFDN2, CRYAB) (પૂરક આકૃતિ 8I), એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર મેટ્રિક્સ (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (પૂરક આકૃતિ 8J), અને રીસેપ્ટર-લિગાન્ડ પ્રવૃત્તિ (FNDC5, SPX, NENF) (પૂરક આકૃતિ 8K) માં સમૃદ્ધ હતા.
ધીમા/ઝડપી સ્નાયુ તંતુ પ્રકારની લાક્ષણિકતાઓ હેઠળના ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ નિયમનમાં વધુ સમજ મેળવવા માટે, અમે SCENIC49 (સપ્લીમેન્ટરી ડેટા સેટ 14) નો ઉપયોગ કરીને ટ્રાન્સક્રિપ્શન ફેક્ટર એન્રિચમેન્ટ વિશ્લેષણ કર્યું. ઝડપી અને ધીમા સ્નાયુ તંતુઓ વચ્ચે ઘણા ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળો નોંધપાત્ર રીતે સમૃદ્ધ થયા હતા (આકૃતિ 4E). આમાં MAFA જેવા ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળોનો સમાવેશ થાય છે, જે અગાઉ ઝડપી સ્નાયુ તંતુ વિકાસ સાથે જોડાયેલા છે,50 તેમજ સ્નાયુ તંતુ પ્રકાર-વિશિષ્ટ જનીન કાર્યક્રમો સાથે અગાઉ સંકળાયેલા ન હોય તેવા ઘણા ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળોનો સમાવેશ થાય છે. આમાંથી, PITX1, EGR1, અને MYF6 ઝડપી સ્નાયુ તંતુઓમાં સૌથી વધુ સમૃદ્ધ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળો હતા (આકૃતિ 4E). તેનાથી વિપરીત, ZSCAN30 અને EPAS1 (જેને HIF2A તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે) ધીમા સ્નાયુ તંતુઓમાં સૌથી વધુ સમૃદ્ધ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળો હતા (આકૃતિ 4E). આ સાથે સુસંગત, MAFA ઝડપી સ્નાયુ તંતુઓને અનુરૂપ UMAP ક્ષેત્રમાં ઉચ્ચ સ્તરે વ્યક્ત કરવામાં આવ્યું હતું, જ્યારે EPAS1 માં વિપરીત અભિવ્યક્તિ પેટર્ન હતી (આકૃતિ 4F).
જાણીતા પ્રોટીન-કોડિંગ જનીનો ઉપરાંત, અસંખ્ય નોન-કોડિંગ RNA બાયોટાઇપ્સ છે જે માનવ વિકાસ અને રોગના નિયમનમાં સામેલ હોઈ શકે છે. 51, 52 ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ ડેટાસેટ્સમાં, ઘણા નોન-કોડિંગ RNAs ફાઇબર પ્રકારની વિશિષ્ટતા દર્શાવે છે (આકૃતિ 5A અને પૂરક ડેટાસેટ 15), જેમાં LINC01405નો સમાવેશ થાય છે, જે ધીમા તંતુઓ માટે ખૂબ જ વિશિષ્ટ છે અને મિટોકોન્ડ્રીયલ માયોપથી ધરાવતા દર્દીઓમાંથી સ્નાયુમાં ઘટાડો થયો હોવાનું નોંધાયું છે. 53 તેનાથી વિપરીત, RP11-255P5.3, lnc-ERCC5-5 જનીન (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54 ને અનુરૂપ, ઝડપી ફાઇબર પ્રકારની વિશિષ્ટતા દર્શાવે છે. LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) અને RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) બંને હાડપિંજરના સ્નાયુ વિશિષ્ટતા દર્શાવે છે (પૂરક આકૃતિઓ 9A–B) અને તેમના 1 Mb જીનોમિક પડોશમાં કોઈ જાણીતા સંકોચનીય જનીનો નથી, જે સૂચવે છે કે તેઓ પડોશી સંકોચનીય જનીનોને નિયંત્રિત કરવાને બદલે ફાઇબર પ્રકારોને નિયંત્રિત કરવામાં વિશિષ્ટ ભૂમિકા ભજવે છે. અનુક્રમે LINC01405 અને RP11-255P5.3 ના ધીમા/ઝડપી ફાઇબર પ્રકાર-વિશિષ્ટ અભિવ્યક્તિ પ્રોફાઇલ્સ RNAscope (આકૃતિઓ 5B–C) નો ઉપયોગ કરીને પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી.
A. નોન-કોડિંગ RNA ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ ધીમા અને ઝડપી-ટ્વિચ સ્નાયુ તંતુઓમાં નોંધપાત્ર રીતે નિયંત્રિત થાય છે. B. પ્રતિનિધિ RNAસ્કોપ છબીઓ જે અનુક્રમે LINC01405 અને RP11-255P5.3 ની ધીમા અને ઝડપી-ટ્વિચ ફાઇબર પ્રકારની વિશિષ્ટતા દર્શાવે છે. સ્કેલ બાર = 50 μm. C. RNAસ્કોપ દ્વારા નક્કી કરાયેલ માયોફાઇબર પ્રકાર-વિશિષ્ટ નોન-કોડિંગ RNA અભિવ્યક્તિનું પ્રમાણીકરણ (n = 3 બાયોપ્સી, દરેક વ્યક્તિમાં ઝડપી અને ધીમા સ્નાયુ તંતુઓની તુલના). બે-પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીના ટી-ટેસ્ટનો ઉપયોગ કરીને આંકડાકીય વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. બોક્સ પ્લોટ મધ્ય અને પ્રથમ અને ત્રીજા ચતુર્થાંશ દર્શાવે છે, જેમાં મૂછો લઘુત્તમ અને મહત્તમ મૂલ્યો તરફ નિર્દેશ કરે છે. D. ડી નોવો માઇક્રોબાયલ પ્રોટીન ઓળખ વર્કફ્લો (BioRender.com સાથે બનાવેલ). E. માઇક્રોબાયલ પ્રોટીન LINC01405_ORF408:17441:17358 ખાસ કરીને ધીમા હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓમાં વ્યક્ત થાય છે (સ્વતંત્ર સહભાગીઓ પાસેથી n=5 બાયોપ્સી, દરેક સહભાગીમાં ઝડપી અને ધીમા સ્નાયુ તંતુઓની તુલના). આંકડાકીય વિશ્લેષણ લિમ રેખીય મોડેલ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને પ્રયોગમૂલક બેયેશિયન અભિગમ સાથે કરવામાં આવ્યું હતું, ત્યારબાદ p-મૂલ્ય ગોઠવણ સાથે બહુવિધ સરખામણીઓ માટે બેન્જામિન-હોચબર્ગ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. બોક્સ પ્લોટ મધ્ય, પ્રથમ અને ત્રીજા ચતુર્થાંશ દર્શાવે છે, જેમાં મૂછો મહત્તમ/લઘુત્તમ મૂલ્યો તરફ નિર્દેશ કરે છે.
તાજેતરમાં, અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે ઘણા અનુમાનિત નોન-કોડિંગ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ કરેલા માઇક્રોબાયલ પ્રોટીનને એન્કોડ કરે છે, જેમાંથી કેટલાક સ્નાયુ કાર્યને નિયંત્રિત કરે છે. 44, 55 સંભવિત ફાઇબર પ્રકારની વિશિષ્ટતા ધરાવતા માઇક્રોબાયલ પ્રોટીનને ઓળખવા માટે, અમે 1000 ફાઇબર ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ ડેટાસેટ (આકૃતિ 5D) માં મળેલા નોન-કોડિંગ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ (n = 305) ના સિક્વન્સ ધરાવતી કસ્ટમ FASTA ફાઇલનો ઉપયોગ કરીને અમારા 1000 ફાઇબર પ્રોટીઓમ ડેટાસેટની શોધ કરી. અમે 22 વિવિધ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સમાંથી 197 માઇક્રોબાયલ પ્રોટીન ઓળખ્યા, જેમાંથી 71 ધીમા અને ઝડપી હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓ વચ્ચે અલગ રીતે નિયંત્રિત હતા (પૂરક આકૃતિ 9C અને પૂરક ડેટા સેટ 16). LINC01405 માટે, ત્રણ માઇક્રોબાયલ પ્રોટીન ઉત્પાદનો ઓળખવામાં આવ્યા હતા, જેમાંથી એક તેના ટ્રાન્સક્રિપ્ટ (આકૃતિ 5E અને પૂરક આકૃતિ 9D) જેવી જ ધીમી ફાઇબર વિશિષ્ટતા દર્શાવે છે. આમ, અમે LINC01405 ને ધીમા હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓ માટે વિશિષ્ટ માઇક્રોબાયલ પ્રોટીનને એન્કોડ કરતા જનીન તરીકે ઓળખ્યા.
અમે વ્યક્તિગત સ્નાયુ તંતુઓના મોટા પાયે પ્રોટીઓમિક લાક્ષણિકતા અને સ્વસ્થ સ્થિતિમાં ફાઇબર વિજાતીયતાના ઓળખાયેલા નિયમનકારો માટે એક વ્યાપક વર્કફ્લો વિકસાવ્યો છે. અમે આ વર્કફ્લોને સમજવા માટે લાગુ કર્યો છે કે નેમાલાઇન માયોપેથી હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુ વિજાતીયતાને કેવી રીતે અસર કરે છે. નેમાલાઇન માયોપેથી એ વારસાગત સ્નાયુ રોગો છે જે સ્નાયુઓની નબળાઈનું કારણ બને છે અને અસરગ્રસ્ત બાળકોમાં, શ્વસન તકલીફ, સ્કોલિયોસિસ અને મર્યાદિત અંગ ગતિશીલતા સહિત વિવિધ ગૂંચવણો સાથે હાજર હોય છે. 19,20 સામાન્ય રીતે, નેમાલાઇન માયોપેથીમાં, એક્ટિન આલ્ફા 1 (ACTA1) જેવા જનીનોમાં રોગકારક પ્રકારો સ્લો-ટ્વિચ ફાઇબર માયોફાઇબર રચનાનું વર્ચસ્વ ધરાવે છે, જોકે આ અસર વિજાતીય છે. એક નોંધપાત્ર અપવાદ ટ્રોપોનિન T1 નેમાલાઇન માયોપેથી (TNNT1) છે, જેમાં ઝડપી તંતુઓનું વર્ચસ્વ છે. આમ, નેમાલાઇન માયોપેથીમાં જોવા મળતા હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુના ડિસરેગ્યુલેશન હેઠળની વિજાતીયતાની વધુ સારી સમજણ આ રોગો અને માયોફાઇબર પ્રકાર વચ્ચેના જટિલ સંબંધને ઉઘાડવામાં મદદ કરી શકે છે.
સ્વસ્થ નિયંત્રણો (n=3 પ્રતિ જૂથ) ની તુલનામાં, ACTA1 અને TNNT1 જનીનોમાં પરિવર્તન ધરાવતા નેમાલાઇન માયોપેથી દર્દીઓમાંથી અલગ કરાયેલા માયોફાઇબર્સમાં ચિહ્નિત માયોફાઇબર એટ્રોફી અથવા ડિસ્ટ્રોફી દર્શાવવામાં આવી હતી (આકૃતિ 6A, પૂરક કોષ્ટક 3). ઉપલબ્ધ સામગ્રીની મર્યાદિત માત્રાને કારણે આનાથી પ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણ માટે નોંધપાત્ર તકનીકી પડકારો રજૂ થયા. આ હોવા છતાં, અમે 272 હાડપિંજરના માયોફાઇબરમાં 2485 પ્રોટીન શોધી શક્યા. પ્રતિ ફાઇબર ઓછામાં ઓછા 1000 ક્વોન્ટિફાઇડ પ્રોટીન માટે ફિલ્ટર કર્યા પછી, 250 ફાઇબરને અનુગામી બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ વિશ્લેષણને આધિન કરવામાં આવ્યા. ફિલ્ટર કર્યા પછી, પ્રતિ ફાઇબર સરેરાશ 1573 ± 359 પ્રોટીનનું પ્રમાણ નક્કી કરવામાં આવ્યું (પૂરક આકૃતિ 10A, પૂરક ડેટા સેટ્સ 17-18). નોંધનીય છે કે, ફાઇબરના કદમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો હોવા છતાં, નેમાલાઇન માયોપેથી દર્દીના નમૂનાઓની પ્રોટીઓમ ઊંડાઈ માત્ર સામાન્ય રીતે ઓછી થઈ હતી. વધુમાં, અમારી પોતાની FASTA ફાઇલો (નોન-કોડિંગ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સ સહિત) નો ઉપયોગ કરીને આ ડેટાને પ્રોસેસ કરવાથી અમને નેમાલાઇન માયોપેથી દર્દીઓમાંથી સ્કેલેટલ માયોફાઇબર્સમાં પાંચ માઇક્રોબાયલ પ્રોટીન ઓળખવાની મંજૂરી મળી (સપ્લીમેન્ટરી ડેટા સેટ 19). પ્રોટીઓમની ગતિશીલ શ્રેણી નોંધપાત્ર રીતે વ્યાપક હતી, અને નિયંત્રણ જૂથમાં કુલ પ્રોટીન અગાઉના 1000-ફાઇબર પ્રોટીઓમ વિશ્લેષણ (પૂરક આકૃતિ 10B-C) ના પરિણામો સાથે સારી રીતે સંબંધિત હતા.
A. ACTA1 અને TNNT1 નેમાલાઇન માયોપેથી (NM) માં MYH પર આધારિત ફાઇબર એટ્રોફી અથવા ડિસ્ટ્રોફી અને વિવિધ ફાઇબર પ્રકારોનું વર્ચસ્વ દર્શાવતી માઇક્રોસ્કોપિક છબીઓ. સ્કેલ બાર = 100 μm. ACTA1 અને TNNT1 દર્દીઓમાં સ્ટેનિંગની પ્રજનનક્ષમતા સુનિશ્ચિત કરવા માટે, પ્રતિનિધિ છબીઓ પસંદ કરતા પહેલા ત્રણ દર્દી બાયોપ્સી બે થી ત્રણ વખત (કેસ દીઠ ચાર વિભાગો) સ્ટેન કરવામાં આવી હતી. B. MYH પર આધારિત સહભાગીઓમાં ફાઇબર પ્રકારનું પ્રમાણ. C. નેમાલાઇન માયોપેથી અને નિયંત્રણો ધરાવતા દર્દીઓમાં હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓનો મુખ્ય ઘટક વિશ્લેષણ (PCA) પ્લોટ. D. આકૃતિ 2 માં વિશ્લેષણ કરાયેલ 1000 તંતુઓમાંથી નિર્ધારિત PCA પ્લોટ પર પ્રક્ષેપિત નેમાલાઇન માયોપેથી અને નિયંત્રણો ધરાવતા દર્દીઓમાંથી હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓ. ઉદાહરણ તરીકે, ACTA1 અને TNNT1 નેમાલાઇન માયોપેથી અને નિયંત્રણો ધરાવતા સહભાગીઓ વચ્ચેના તફાવતોની તુલના કરતા જ્વાળામુખી પ્લોટ. રંગીન વર્તુળો એવા પ્રોટીન દર્શાવે છે જે π < 0.05 પર નોંધપાત્ર રીતે અલગ હતા, અને ઘેરા બિંદુઓ એવા પ્રોટીન દર્શાવે છે જે FDR < 0.05 પર નોંધપાત્ર રીતે અલગ હતા. આંકડાકીય વિશ્લેષણ લિમ્મા રેખીય મોડેલ પદ્ધતિ અને પ્રયોગમૂલક બેયેશિયન પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું, ત્યારબાદ બેન્જામિન-હોચબર્ગ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને બહુવિધ સરખામણીઓ માટે p-મૂલ્ય ગોઠવણ કરવામાં આવી હતી. H. સમગ્ર પ્રોટીઓમ અને પ્રકાર 1 અને 2A તંતુઓમાં નોંધપાત્ર રીતે અલગ રીતે વ્યક્ત કરાયેલા પ્રોટીનનું સંવર્ધન વિશ્લેષણ. ક્લસ્ટર પ્રોફાઇલર પેકેજ અને બેન્જામિન-હોચબર્ગ સમાયોજિત p-મૂલ્યોનો ઉપયોગ કરીને આંકડાકીય વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું. I, J. મુખ્ય ઘટક વિશ્લેષણ (PCA) પ્લોટ બાહ્યકોષીય મેટ્રિક્સ અને માઇટોકોન્ડ્રીયલ જનીન ઓન્ટોલોજી (GO) શબ્દો દ્વારા રંગીન.
કારણ કે નેમાલાઇન માયોપેથી હાડપિંજરના સ્નાયુઓમાં MYH-વ્યક્ત માયોફાઇબર પ્રકારોના પ્રમાણને પ્રભાવિત કરી શકે છે, 19,20 અમે સૌપ્રથમ નેમાલાઇન માયોપેથી અને નિયંત્રણો ધરાવતા દર્દીઓમાં MYH-વ્યક્ત માયોફાઇબર પ્રકારોની તપાસ કરી. અમે 1000 માયોફાઇબર પરખ (પૂરક આકૃતિઓ 10D–E) માટે અગાઉ વર્ણવેલ નિષ્પક્ષ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને માયોફાઇબર પ્રકાર નક્કી કર્યો અને ફરીથી શુદ્ધ 2X માયોફાઇબર (આકૃતિ 6B) ઓળખવામાં નિષ્ફળ ગયા. અમે માયોફાઇબર પ્રકાર પર નેમાલાઇન માયોપેથીની વિજાતીય અસર જોઈ, કારણ કે ACTA1 પરિવર્તન ધરાવતા બે દર્દીઓમાં પ્રકાર 1 માયોફાઇબરનું પ્રમાણ વધ્યું હતું, જ્યારે TNNT1 નેમાલાઇન માયોપેથી ધરાવતા બે દર્દીઓમાં પ્રકાર 1 માયોફાઇબરનું પ્રમાણ ઘટ્યું હતું (આકૃતિ 6B). ખરેખર, ACTA1-નેમાલાઇન માયોપેથીમાં MYH2 અને ફાસ્ટ ટ્રોપોનિન આઇસોફોર્મ્સ (TNNC2, TNNI2, અને TNNT3) ની અભિવ્યક્તિમાં ઘટાડો થયો હતો, જ્યારે TNNT1-નેમાલાઇન માયોપેથીમાં MYH7 અભિવ્યક્તિમાં ઘટાડો થયો હતો (પૂરક આકૃતિ 11A). આ નેમાલાઇન માયોપેથીમાં વિજાતીય માયોફાઇબર પ્રકાર સ્વિચિંગના અગાઉના અહેવાલો સાથે સુસંગત છે.19,20 અમે ઇમ્યુનોહિસ્ટોકેમિસ્ટ્રી દ્વારા આ પરિણામોની પુષ્ટિ કરી અને જોયું કે ACTA1-નેમાલાઇન માયોપેથી ધરાવતા દર્દીઓમાં પ્રકાર 1 માયોફાઇબરનું વર્ચસ્વ હતું, જ્યારે TNNT1-નેમાલાઇન માયોપેથી ધરાવતા દર્દીઓમાં વિપરીત પેટર્ન હતી (આકૃતિ 6A).
સિંગલ-ફાઇબર પ્રોટીઓમ સ્તરે, ACTA1 અને TNNT1 નેમાલાઇન માયોપથી દર્દીઓના હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓ મોટાભાગના નિયંત્રણ તંતુઓ સાથે ક્લસ્ટર થયા હતા, જેમાં TNNT1 નેમાલાઇન માયોપથી તંતુઓ સામાન્ય રીતે સૌથી વધુ અસરગ્રસ્ત હતા (આકૃતિ 6C). દરેક દર્દી માટે સ્યુડો-ફુલાવેલા તંતુઓના મુખ્ય ઘટક વિશ્લેષણ (PCA) પ્લોટનું આયોજન કરતી વખતે આ ખાસ કરીને સ્પષ્ટ થયું હતું, જેમાં TNNT1 નેમાલાઇન માયોપથી દર્દીઓ 2 અને 3 નિયંત્રણ નમૂનાઓથી સૌથી દૂર દેખાયા હતા (પૂરક આકૃતિ 11B, પૂરક ડેટા સેટ 20). માયોપથી દર્દીઓના તંતુઓ સ્વસ્થ તંતુઓ સાથે કેવી રીતે તુલના કરે છે તે વધુ સારી રીતે સમજવા માટે, અમે સ્વસ્થ પુખ્ત સહભાગીઓના 1,000 તંતુઓના પ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણમાંથી મેળવેલી વિગતવાર માહિતીનો ઉપયોગ કર્યો. અમે માયોપથી ડેટાસેટ (ACTA1 અને TNNT1 નેમાલાઇન માયોપથી દર્દીઓ અને નિયંત્રણો) માંથી ફાઇબરને 1000-ફાઇબર પ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણ (આકૃતિ 6D) માંથી મેળવેલા PCA પ્લોટ પર પ્રોજેક્ટ કર્યા. કંટ્રોલ ફાઇબર્સમાં PC2 સાથે MYH ફાઇબર પ્રકારોનું વિતરણ 1000-ફાઇબર પ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણમાંથી મેળવેલા ફાઇબર વિતરણ જેવું જ હતું. જોકે, નેમાલાઇન માયોપથીના દર્દીઓમાં મોટાભાગના ફાઇબર્સ તેમના મૂળ MYH ફાઇબર પ્રકારને ધ્યાનમાં લીધા વિના, સ્વસ્થ ફાસ્ટ-ટ્વિચ ફાઇબર્સ સાથે ઓવરલેપ કરીને PC2 નીચે ખસેડાયા. આમ, ACTA1 નેમાલાઇન માયોપથી ધરાવતા દર્દીઓએ MYH-આધારિત પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરીને ક્વોન્ટિફાઇડ કરવામાં આવે ત્યારે ટાઇપ 1 ફાઇબર્સ તરફ શિફ્ટ દર્શાવી હોવા છતાં, ACTA1 નેમાલાઇન માયોપથી અને TNNT1 નેમાલાઇન માયોપથી બંનેએ હાડપિંજરના સ્નાયુ ફાઇબર પ્રોટીઓમને ફાસ્ટ-ટ્વિચ ફાઇબર્સ તરફ ખસેડ્યા.
ત્યારબાદ અમે દરેક દર્દી જૂથની સીધી સરખામણી સ્વસ્થ નિયંત્રણો સાથે કરી અને ACTA1 અને TNNT1 નેમાલાઇન માયોપેથીમાં અનુક્રમે 256 અને 552 વિભેદક રીતે વ્યક્ત પ્રોટીન ઓળખ્યા (આકૃતિ 6E-G અને પૂરક આકૃતિ 11C, પૂરક ડેટા સેટ 21). જનીન સંવર્ધન વિશ્લેષણમાં માઇટોકોન્ડ્રિયલ પ્રોટીનમાં સંકલિત ઘટાડો જાહેર થયો (આકૃતિ 6H-I, પૂરક ડેટા સેટ 22). આશ્ચર્યજનક રીતે, ACTA1 અને TNNT1 નેમાલાઇન માયોપેથીમાં ફાઇબર પ્રકારોનું વિભેદક વર્ચસ્વ હોવા છતાં, આ ઘટાડો MYH-આધારિત ફાઇબર પ્રકાર (આકૃતિ 6H અને પૂરક આકૃતિ 11D-I, પૂરક ડેટા સેટ 23) થી સંપૂર્ણપણે સ્વતંત્ર હતો. ACTA1 અથવા TNNT1 નેમાલાઇન માયોપેથીમાં ત્રણ માઇક્રોબાયલ પ્રોટીન પણ નિયંત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા. આમાંથી બે માઇક્રોપ્રોટીન, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (જેને LINC00598 અથવા Lnc-FOXO1 તરીકે પણ ઓળખવામાં આવે છે) અને ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), ફક્ત પ્રકાર 1 માયોફાઇબર્સમાં વિભેદક વિપુલતા દર્શાવે છે. ENSG00000215483_TR14_ORF67 અગાઉ કોષ ચક્ર નિયમનમાં ભૂમિકા ભજવે છે તેવું નોંધાયું છે. 56 બીજી બાજુ, સ્વસ્થ નિયંત્રણોની તુલનામાં ACTA1-નેમાલાઇન માયોપેથીમાં પ્રકાર 1 અને પ્રકાર 2A માયોફાઇબર બંનેમાં ENSG00000232046_TR1_ORF437 (LINC01798 ને અનુરૂપ) વધ્યું હતું (પૂરક આકૃતિ 12A, પૂરક ડેટા સેટ 24). તેનાથી વિપરીત, રાઇબોસોમલ પ્રોટીન મોટાભાગે નેમાલાઇન માયોપેથીથી અપ્રભાવિત હતા, જોકે ACTA1 નેમાલાઇન માયોપેથી (આકૃતિ 6E) માં RPS17 ડાઉનરેગ્યુલેટેડ હતું.
સંવર્ધન વિશ્લેષણમાં ACTA1 અને TNNT1 નેમાલાઇન માયોપેથીમાં રોગપ્રતિકારક તંત્ર પ્રક્રિયાઓનું અપરેગ્યુલેશન પણ બહાર આવ્યું છે, જ્યારે TNNT1 નેમાલાઇન માયોપેથીમાં કોષ સંલગ્નતામાં પણ વધારો થયો હતો (આકૃતિ 6H). આ બાહ્યકોષીય પરિબળોનું સંવર્ધન બાહ્યકોષીય મેટ્રિક્સ પ્રોટીન દ્વારા પ્રતિબિંબિત થયું હતું જે PC1 અને PC2 માં PCA ને નકારાત્મક દિશામાં ખસેડી રહ્યા હતા (એટલે ​​\u200b\u200bકે, સૌથી વધુ અસરગ્રસ્ત તંતુઓ તરફ) (આકૃતિ 6J). બંને દર્દી જૂથોએ રોગપ્રતિકારક પ્રતિભાવો અને સાર્કોલેમલ રિપેર મિકેનિઝમ્સમાં સામેલ બાહ્યકોષીય પ્રોટીનની વધેલી અભિવ્યક્તિ દર્શાવી હતી, જેમ કે એનેક્સિન્સ (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 અને તેમના ઇન્ટરેક્ટિંગ પ્રોટીન S100A1159 (પૂરક આકૃતિઓ 12B–C). આ પ્રક્રિયા અગાઉ સ્નાયુબદ્ધ ડિસ્ટ્રોફીમાં ઉન્નત હોવાનું નોંધાયું છે60 પરંતુ, અમારા જ્ઞાન મુજબ, અગાઉ નેમાલાઇન માયોપેથી સાથે સંકળાયેલી નથી. ઈજા પછી સાર્કોલેમલ રિપેર માટે અને નવા રચાયેલા માયોસાઇટ્સના માયોફાઇબર સાથે મિશ્રણ માટે આ પરમાણુ મશીનરીનું સામાન્ય કાર્ય જરૂરી છે58,61. આમ, બંને દર્દી જૂથોમાં આ પ્રક્રિયાની વધેલી પ્રવૃત્તિ માયોફાઇબર અસ્થિરતાને કારણે થતી ઈજા માટે રિપેરેટિવ પ્રતિભાવ સૂચવે છે.
દરેક નેમાલાઇન માયોપથીની અસરો સારી રીતે સહસંબંધિત હતી (r = 0.736) અને વાજબી ઓવરલેપ દર્શાવ્યું (પૂરક આકૃતિઓ 11A–B), જે દર્શાવે છે કે ACTA1 અને TNNT1 નેમાલાઇન માયોપથી પ્રોટીઓમ પર સમાન અસરો ધરાવે છે. જો કે, કેટલાક પ્રોટીન ફક્ત ACTA1 અથવા TNNT1 નેમાલાઇન માયોપથીમાં નિયંત્રિત હતા (પૂરક આકૃતિઓ 11A અને C). પ્રોફિબ્રોટિક પ્રોટીન MFAP4 TNNT1 નેમાલાઇન માયોપથીમાં સૌથી વધુ અપરેગ્યુલેટેડ પ્રોટીનમાંનું એક હતું પરંતુ ACTA1 નેમાલાઇન માયોપથીમાં યથાવત રહ્યું. HOX જનીન ટ્રાન્સક્રિપ્શનનું નિયમન કરવા માટે જવાબદાર PAF1C સંકુલનો એક ઘટક SKIC8, TNNT1 નેમાલાઇન માયોપથીમાં ડાઉનરેગ્યુલેટેડ હતો પરંતુ ACTA1 નેમાલાઇન માયોપથીમાં અસરગ્રસ્ત થયો ન હતો (પૂરક આકૃતિ 11A). ACTA1 અને TNNT1 નેમાલાઇન માયોપથીની સીધી સરખામણીએ TNNT1 નેમાલાઇન માયોપથીમાં માઇટોકોન્ડ્રીયલ પ્રોટીનમાં વધુ ઘટાડો અને રોગપ્રતિકારક તંત્ર પ્રોટીનમાં વધારો દર્શાવ્યો (આકૃતિ 6G-H અને પૂરક આકૃતિઓ 11C અને 11H-I). આ ડેટા TNNT1 નેમાલાઇન માયોપથી (આકૃતિ 6A) ની તુલનામાં TNNT1 નેમાલાઇન માયોપથીમાં જોવા મળેલા મોટા એટ્રોફી/ડિસ્ટ્રોફી સાથે સુસંગત છે, જે સૂચવે છે કે TNNT1 નેમાલાઇન માયોપથી રોગના વધુ ગંભીર સ્વરૂપનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે.
નેમાલાઇન માયોપથીની અવલોકન કરાયેલી અસરો સમગ્ર સ્નાયુ સ્તરે ચાલુ રહે છે કે કેમ તેનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે, અમે TNNT1 નેમાલાઇન માયોપથી દર્દીઓના સમાન જૂથમાંથી સ્નાયુ બાયોપ્સીનું બલ્ક પ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણ કર્યું અને તેમની સરખામણી નિયંત્રણો (n=3 પ્રતિ જૂથ) સાથે કરી (પૂરક આકૃતિ 13A, પૂરક ડેટા સેટ 25). અપેક્ષા મુજબ, મુખ્ય ઘટક વિશ્લેષણમાં નિયંત્રણો નજીકથી સંબંધિત હતા, જ્યારે TNNT1 નેમાલાઇન માયોપથી દર્દીઓએ સિંગલ ફાઇબર વિશ્લેષણ (પૂરક આકૃતિ 13B) માં જોવા મળતી સમાન ઉચ્ચ ઇન્ટરસેમ્પલ પરિવર્તનશીલતા દર્શાવી. બલ્ક વિશ્લેષણમાં વ્યક્તિગત તંતુઓની તુલના કરીને પ્રકાશિત વિભેદક રીતે વ્યક્ત કરાયેલ પ્રોટીન (પૂરક આકૃતિ 13C, પૂરક ડેટા સેટ 26) અને જૈવિક પ્રક્રિયાઓ (પૂરક આકૃતિ 13D, પૂરક ડેટા સેટ 27) નું પુનઃઉત્પાદન કરવામાં આવ્યું, પરંતુ વિવિધ ફાઇબર પ્રકારો વચ્ચે તફાવત કરવાની ક્ષમતા ગુમાવી દીધી અને તંતુઓમાં વિજાતીય રોગની અસરો માટે જવાબદાર રહેવામાં નિષ્ફળ ગયા.
એકસાથે લેવામાં આવે તો, આ ડેટા દર્શાવે છે કે સિંગલ-માયોફાઇબર પ્રોટીઓમિક્સ ક્લિનિકલ જૈવિક લક્ષણોને સ્પષ્ટ કરી શકે છે જે ઇમ્યુનોબ્લોટિંગ જેવી લક્ષિત પદ્ધતિઓ દ્વારા શોધી શકાતા નથી. વધુમાં, આ ડેટા ફેનોટાઇપિક અનુકૂલનનું વર્ણન કરવા માટે ફક્ત એક્ટિન ફાઇબર ટાઇપિંગ (MYH) નો ઉપયોગ કરવાની મર્યાદાઓને પ્રકાશિત કરે છે. ખરેખર, જોકે ફાઇબર પ્રકાર સ્વિચિંગ એક્ટિન અને ટ્રોપોનિન નેમાલાઇન માયોપેથી વચ્ચે અલગ પડે છે, બંને નેમાલાઇન માયોપેથી MYH ફાઇબર ટાઇપિંગને હાડપિંજરના સ્નાયુ ફાઇબર ચયાપચયથી ઝડપી અને ઓછા ઓક્સિડેટીવ સ્નાયુ પ્રોટીઓમ તરફ અલગ કરે છે.
પેશીઓ માટે તેમની વિવિધ માંગણીઓ પૂરી કરવા માટે કોષીય વિજાતીયતા મહત્વપૂર્ણ છે. હાડપિંજરના સ્નાયુઓમાં, આને ઘણીવાર ફાઇબર પ્રકારો તરીકે વર્ણવવામાં આવે છે જે બળ ઉત્પાદન અને થાકની વિવિધ ડિગ્રી દ્વારા વર્ગીકૃત થયેલ છે. જો કે, તે સ્પષ્ટ છે કે આ હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુ પરિવર્તનશીલતાના માત્ર એક નાના ભાગને સમજાવે છે, જે અગાઉ વિચાર્યા કરતા ઘણું વધુ ચલ, જટિલ અને બહુપક્ષીય છે. તકનીકી પ્રગતિએ હવે હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓનું નિયમન કરતા પરિબળો પર પ્રકાશ પાડ્યો છે. ખરેખર, અમારા ડેટા સૂચવે છે કે પ્રકાર 2X તંતુઓ એક અલગ હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુ પેટા પ્રકાર ન હોઈ શકે. વધુમાં, અમે મેટાબોલિક પ્રોટીન, રિબોસોમલ પ્રોટીન અને કોષ-સંકળાયેલ પ્રોટીનને હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુ વિજાતીયતાના મુખ્ય નિર્ણાયકો તરીકે ઓળખ્યા. નેમાટોડ માયોપથી ધરાવતા દર્દીના નમૂનાઓ પર અમારા પ્રોટીઓમિક વર્કફ્લો લાગુ કરીને, અમે વધુ દર્શાવ્યું કે MYH-આધારિત ફાઇબર ટાઇપિંગ હાડપિંજરના સ્નાયુ વિજાતીયતાને સંપૂર્ણપણે પ્રતિબિંબિત કરતું નથી, ખાસ કરીને જ્યારે સિસ્ટમ ખલેલ પહોંચાડે છે. ખરેખર, MYH-આધારિત ફાઇબર પ્રકારને ધ્યાનમાં લીધા વિના, નેમાટોડ માયોપથી ઝડપી અને ઓછા ઓક્સિડેટીવ તંતુઓ તરફ સ્થળાંતરમાં પરિણમે છે.
19મી સદીથી હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓનું વર્ગીકરણ કરવામાં આવ્યું છે. તાજેતરના ઓમિક્સ વિશ્લેષણથી અમને વિવિધ MYH ફાઇબર પ્રકારોના અભિવ્યક્તિ પ્રોફાઇલ્સ અને વિવિધ ઉત્તેજના પ્રત્યેના તેમના પ્રતિભાવો સમજવામાં મદદ મળી છે. અહીં વર્ણવ્યા મુજબ, ઓમિક્સ અભિગમોમાં પરંપરાગત એન્ટિબોડી-આધારિત પદ્ધતિઓ કરતાં ફાઇબર પ્રકારના માર્કર્સનું પ્રમાણ નક્કી કરવા માટે વધુ સંવેદનશીલતાનો ફાયદો પણ છે, હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુના પ્રકારને વ્યાખ્યાયિત કરવા માટે એક (અથવા થોડા) માર્કર્સના જથ્થા પર આધાર રાખ્યા વિના. અમે પૂરક ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક અને પ્રોટીઓમિક વર્કફ્લોનો ઉપયોગ કર્યો અને માનવ હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓમાં ફાઇબર વિજાતીયતાના ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ અને પોસ્ટ-ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ નિયમનની તપાસ કરવા માટે પરિણામોને એકીકૃત કર્યા. આ કાર્યપ્રવાહના પરિણામે અમારા સ્વસ્થ યુવાનોના વાસ્ટસ લેટરલિસમાં પ્રોટીન સ્તરે શુદ્ધ 2X-પ્રકારના તંતુઓ ઓળખવામાં નિષ્ફળતા મળી. આ અગાઉના સિંગલ ફાઇબર અભ્યાસો સાથે સુસંગત છે જેમાં સ્વસ્થ વાસ્ટસ લેટરલિસમાં <1% શુદ્ધ 2X તંતુઓ મળ્યા હતા, જોકે ભવિષ્યમાં અન્ય સ્નાયુઓમાં આની પુષ્ટિ થવી જોઈએ. mRNA સ્તરે લગભગ શુદ્ધ 2X તંતુઓ અને પ્રોટીન સ્તરે ફક્ત મિશ્ર 2A/2X તંતુઓની શોધ વચ્ચેનો તફાવત મૂંઝવણભર્યો છે. MYH આઇસોફોર્મ mRNA અભિવ્યક્તિ સર્કેડિયન નથી, 67 સૂચવે છે કે RNA સ્તરે દેખીતી રીતે શુદ્ધ 2X તંતુઓમાં આપણે MYH2 શરૂઆત સંકેત "ચૂકી" ગયા હોવાની શક્યતા નથી. એક શક્ય સમજૂતી, જોકે સંપૂર્ણપણે કાલ્પનિક છે, MYH આઇસોફોર્મ્સ વચ્ચે પ્રોટીન અને/અથવા mRNA સ્થિરતામાં તફાવત હોઈ શકે છે. ખરેખર, કોઈપણ MYH આઇસોફોર્મ માટે કોઈ ઝડપી ફાઇબર 100% શુદ્ધ નથી, અને તે સ્પષ્ટ નથી કે 70-90% શ્રેણીમાં MYH1 mRNA અભિવ્યક્તિ સ્તર પ્રોટીન સ્તરે સમાન MYH1 અને MYH2 વિપુલતામાં પરિણમશે કે નહીં. જો કે, સમગ્ર ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ અથવા પ્રોટીઓમને ધ્યાનમાં લેતી વખતે, ક્લસ્ટર વિશ્લેષણ વિશ્વાસપૂર્વક ફક્ત બે અલગ ક્લસ્ટરોને ઓળખી શકે છે જે ધીમા અને ઝડપી હાડપિંજર સ્નાયુ તંતુઓનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે, તેમની ચોક્કસ MYH રચનાને ધ્યાનમાં લીધા વિના. આ સિંગલ-ન્યુક્લિયસ ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક અભિગમોનો ઉપયોગ કરીને વિશ્લેષણ સાથે સુસંગત છે, જે સામાન્ય રીતે ફક્ત બે અલગ માયોન્યુક્લિયર ક્લસ્ટરોને ઓળખે છે. 68, 69, 70 વધુમાં, અગાઉના પ્રોટીઓમિક અભ્યાસોએ પ્રકાર 2X તંતુઓ ઓળખી કાઢ્યા હોવા છતાં, આ તંતુઓ બાકીના ઝડપી તંતુઓથી અલગ રીતે ક્લસ્ટર થતા નથી અને MYH પર આધારિત અન્ય ફાઇબર પ્રકારોની તુલનામાં માત્ર થોડી સંખ્યામાં વિભિન્ન રીતે વિપુલ પ્રમાણમાં પ્રોટીન દર્શાવે છે. 14 આ પરિણામો સૂચવે છે કે આપણે સ્નાયુ તંતુ વર્ગીકરણના 20મી સદીના પ્રારંભિક દૃષ્ટિકોણ પર પાછા ફરવું જોઈએ, જેણે માનવ હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓને MYH પર આધારિત ત્રણ અલગ વર્ગોમાં નહીં, પરંતુ તેમના મેટાબોલિક અને સંકોચન ગુણધર્મોના આધારે બે ક્લસ્ટરોમાં વિભાજિત કર્યા હતા. 63
વધુ અગત્યનું, માયોફાઇબર વિજાતીયતાને બહુવિધ પરિમાણો સાથે ધ્યાનમાં લેવી જોઈએ. અગાઉના "ઓમિક્સ" અભ્યાસોએ આ દિશામાં નિર્દેશ કર્યો છે, જે સૂચવે છે કે હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓ અલગ ક્લસ્ટરો બનાવતા નથી પરંતુ એક સાતત્ય સાથે ગોઠવાયેલા છે. 11, 13, 14, 64, 71 અહીં, અમે બતાવીએ છીએ કે, હાડપિંજરના સ્નાયુના સંકોચન અને ચયાપચય ગુણધર્મોમાં તફાવત ઉપરાંત, માયોફાઇબર્સને કોષ-કોષ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ અને અનુવાદ પદ્ધતિઓ સંબંધિત સુવિધાઓ દ્વારા અલગ કરી શકાય છે. ખરેખર, અમને હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓમાં રાઇબોઝોમ વિજાતીયતા મળી છે જે ધીમા અને ઝડપી ફાઇબર પ્રકારોથી સ્વતંત્ર વિજાતીયતામાં ફાળો આપે છે. ધીમા અને ઝડપી ફાઇબર પ્રકારથી સ્વતંત્ર, આ નોંધપાત્ર માયોફાઇબર વિજાતીયતાનું મૂળ કારણ અસ્પષ્ટ રહે છે, પરંતુ તે સ્નાયુ ફેસિકલ્સમાં વિશિષ્ટ અવકાશી સંગઠન તરફ નિર્દેશ કરી શકે છે જે ચોક્કસ દળો અને ભારને શ્રેષ્ઠ રીતે પ્રતિભાવ આપે છે, 72 સ્નાયુ સૂક્ષ્મ પર્યાવરણમાં અન્ય કોષ પ્રકારો સાથે વિશિષ્ટ સેલ્યુલર અથવા અંગ-વિશિષ્ટ સંચાર 73,74,75 અથવા વ્યક્તિગત માયોફાઇબરમાં રાઇબોઝોમ પ્રવૃત્તિમાં તફાવત. ખરેખર, રિબોસોમલ હેટરોપ્લાઝમી, કાં તો RPL3 અને RPL3L ના પેરાલોગસ અવેજી દ્વારા અથવા rRNA ના 2′O-મેથિલેશનના સ્તરે, હાડપિંજરના સ્નાયુ હાઇપરટ્રોફી સાથે સંકળાયેલ હોવાનું દર્શાવવામાં આવ્યું છે76,77. વ્યક્તિગત માયોફાઇબર્સના કાર્યાત્મક લાક્ષણિકતા સાથે જોડાયેલી બહુ-ઓમિક અને અવકાશી એપ્લિકેશનો બહુ-ઓમિક સ્તર78 પર સ્નાયુ જીવવિજ્ઞાનની આપણી સમજને વધુ આગળ વધારશે.
નેમાલાઇન માયોપેથી ધરાવતા દર્દીઓમાંથી સિંગલ માયોફાઇબર્સના પ્રોટીઓમનું વિશ્લેષણ કરીને, અમે હાડપિંજરના સ્નાયુના ક્લિનિકલ પેથોફિઝિયોલોજીને સ્પષ્ટ કરવા માટે સિંગલ માયોફાઇબર પ્રોટીઓમિક્સની ઉપયોગિતા, અસરકારકતા અને લાગુ પડવાની ક્ષમતા પણ દર્શાવી. વધુમાં, અમારા કાર્યપ્રવાહની વૈશ્વિક પ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણ સાથે સરખામણી કરીને, અમે દર્શાવવામાં સક્ષમ હતા કે સિંગલ માયોફાઇબર પ્રોટીઓમિક્સ વૈશ્વિક પેશી પ્રોટીઓમિક્સ જેટલી જ માહિતી આપે છે અને ઇન્ટરફાઇબર વિજાતીયતા અને માયોફાઇબર પ્રકાર માટે ગણતરી કરીને આ ઊંડાણને વિસ્તૃત કરે છે. સ્વસ્થ નિયંત્રણોની તુલનામાં ACTA1 અને TNNT1 નેમાલાઇન માયોપેથીમાં જોવા મળતા ફાઇબર પ્રકાર ગુણોત્તરમાં અપેક્ષિત (ચલ હોવા છતાં) તફાવતો ઉપરાંત, અમે MYH-મધ્યસ્થી ફાઇબર પ્રકાર સ્વિચિંગથી સ્વતંત્ર ઓક્સિડેટીવ અને બાહ્યકોષીય રિમોડેલિંગ પણ અવલોકન કર્યું. TNNT1 નેમાલાઇન માયોપેથીમાં અગાઉ ફાઇબ્રોસિસ નોંધાયું છે.19 જો કે, અમારું વિશ્લેષણ ACTA1 અને TNNT1 નેમાલાઇન માયોપેથી ધરાવતા દર્દીઓના માયોફાઇબર્સમાં સાર્કોલેમલ રિપેર મિકેનિઝમ્સમાં સામેલ એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર સ્ત્રાવિત તાણ-સંબંધિત પ્રોટીન, જેમ કે એનેક્સિન, ના વધેલા સ્તરને પણ જાહેર કરીને આ શોધ પર આધારિત છે.57,58,59 નિષ્કર્ષમાં, નેમાલાઇન માયોપેથી ધરાવતા દર્દીઓના માયોફાઇબર્સમાં એનેક્સિનનું વધેલું સ્તર ગંભીર રીતે એટ્રોફિક માયોફાઇબર્સને સુધારવા માટે સેલ્યુલર પ્રતિભાવ રજૂ કરી શકે છે.
જોકે આ અભ્યાસ આજ સુધીના માનવોના સૌથી મોટા સિંગલ-ફાઇબર આખા-સ્નાયુ-ઓમિક્સ વિશ્લેષણનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે, તે મર્યાદાઓ વિના નથી. અમે સહભાગીઓના પ્રમાણમાં નાના અને એકરૂપ નમૂના અને એક સ્નાયુ (વાસ્ટસ લેટરલિસ) માંથી હાડપિંજરના સ્નાયુ તંતુઓને અલગ કર્યા. તેથી, સ્નાયુ પ્રકારો અને સ્નાયુ શરીરવિજ્ઞાનની ચરમસીમા પર ચોક્કસ ફાઇબર વસ્તીના અસ્તિત્વને બાકાત રાખવું અશક્ય છે. ઉદાહરણ તરીકે, અમે ઉચ્ચ પ્રશિક્ષિત દોડવીરો અને/અથવા તાકાતવાળા રમતવીરોમાં અથવા સ્નાયુ નિષ્ક્રિયતાના સમયગાળા દરમિયાન અલ્ટ્રાફાસ્ટ ફાઇબર (દા.ત., શુદ્ધ 2X ફાઇબર) ના સબસેટ ઉભરવાની શક્યતાને બાકાત રાખી શકતા નથી66,80. વધુમાં, સહભાગીઓના મર્યાદિત નમૂનાના કદે અમને ફાઇબર વિજાતીયતામાં લિંગ તફાવતોની તપાસ કરવાથી અટકાવ્યું, કારણ કે ફાઇબર પ્રકાર ગુણોત્તર પુરુષો અને સ્ત્રીઓ વચ્ચે અલગ હોવાનું જાણીતું છે. વધુમાં, અમે સમાન સ્નાયુ તંતુઓ અથવા સમાન સહભાગીઓના નમૂનાઓ પર ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમિક અને પ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણ કરવામાં અસમર્થ હતા. જેમ જેમ આપણે અને અન્ય લોકો અલ્ટ્રા-લો સેમ્પલ ઇનપુટ (જેમ કે મિટોકોન્ડ્રીયલ માયોપેથી ધરાવતા દર્દીઓના રેસાના વિશ્લેષણમાં દર્શાવવામાં આવ્યું છે) પ્રાપ્ત કરવા માટે ઓમિક્સ વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરીને સિંગલ-સેલ અને સિંગલ-માયોફાઇબર વિશ્લેષણને ઑપ્ટિમાઇઝ કરવાનું ચાલુ રાખીએ છીએ, તેમ સિંગલ સ્નાયુ તંતુઓમાં મલ્ટિ-ઓમિક્સ (અને કાર્યાત્મક) અભિગમોને જોડવાની તક સ્પષ્ટ થાય છે.
એકંદરે, અમારો ડેટા હાડપિંજરના સ્નાયુ વિજાતીયતાના ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ અને પોસ્ટ-ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ ડ્રાઇવરોને ઓળખે છે અને સમજાવે છે. ખાસ કરીને, અમે એવા ડેટા રજૂ કરીએ છીએ જે ફાઇબર પ્રકારોની શાસ્ત્રીય MYH-આધારિત વ્યાખ્યા સાથે સંકળાયેલા હાડપિંજરના સ્નાયુ શરીરવિજ્ઞાનમાં લાંબા સમયથી ચાલતા સિદ્ધાંતને પડકારે છે. અમે ચર્ચાને નવીકરણ કરવાની અને આખરે હાડપિંજરના સ્નાયુ ફાઇબર વર્ગીકરણ અને વિજાતીયતાની અમારી સમજણ પર પુનર્વિચાર કરવાની આશા રાખીએ છીએ.
ચૌદ કોકેશિયન સહભાગીઓ (૧૨ પુરુષો અને ૨ સ્ત્રીઓ) સ્વેચ્છાએ આ અભ્યાસમાં ભાગ લેવા સંમત થયા. આ અભ્યાસને ઘેન્ટ યુનિવર્સિટી હોસ્પિટલ (BC-10237) ની નૈતિક સમિતિ દ્વારા મંજૂરી આપવામાં આવી હતી, 2013 હેલસિંકી ઘોષણાપત્રનું પાલન કરવામાં આવ્યું હતું, અને ClinicalTrials.gov (NCT05131555) પર નોંધાયેલ હતું. સહભાગીઓની સામાન્ય લાક્ષણિકતાઓ પૂરક કોષ્ટક 1 માં રજૂ કરવામાં આવી છે. મૌખિક અને લેખિત જાણકાર સંમતિ મેળવ્યા પછી, અભ્યાસમાં અંતિમ સમાવેશ કરતા પહેલા સહભાગીઓની તબીબી તપાસ કરવામાં આવી. સહભાગીઓ યુવાન (22-42 વર્ષ), સ્વસ્થ (કોઈ તબીબી સ્થિતિ, ધૂમ્રપાનનો ઇતિહાસ નહીં), અને સાધારણ શારીરિક રીતે સક્રિય હતા. અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ શારીરિક તંદુરસ્તીનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે સ્ટેપ એર્ગોમીટરનો ઉપયોગ કરીને મહત્તમ ઓક્સિજન શોષણ નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું. 81
સ્નાયુ બાયોપ્સીના નમૂનાઓ 14 દિવસના અંતરે ત્રણ વખત આરામ અને ઉપવાસની સ્થિતિમાં એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા. કારણ કે આ નમૂનાઓ મોટા અભ્યાસના ભાગ રૂપે એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા, સહભાગીઓએ બાયોપ્સીના 40 મિનિટ પહેલા પ્લેસબો (લેક્ટોઝ), H1-રિસેપ્ટર વિરોધી (540 મિલિગ્રામ ફેક્સોફેનાડાઇન), અથવા H2-રિસેપ્ટર વિરોધી (40 મિલિગ્રામ ફેમોટીડાઇન) નું સેવન કર્યું હતું. અમે અગાઉ દર્શાવ્યું છે કે આ હિસ્ટામાઇન રીસેપ્ટર વિરોધીઓ આરામ કરતા હાડપિંજરના સ્નાયુઓની તંદુરસ્તીને અસર કરતા નથી81, અને અમારા ગુણવત્તા નિયંત્રણ પ્લોટમાં કોઈ સ્થિતિ-સંબંધિત ક્લસ્ટરિંગ જોવા મળ્યું નથી (પૂરક આકૃતિઓ 3 અને 6). દરેક પ્રાયોગિક દિવસ પહેલા 48 કલાક માટે પ્રમાણિત આહાર (41.4 kcal/kg શરીરનું વજન, 5.1 g/kg શરીરનું વજન કાર્બોહાઇડ્રેટ, 1.4 g/kg શરીરનું વજન પ્રોટીન, અને 1.6 g/kg શરીરનું વજન ચરબી) જાળવવામાં આવ્યું હતું, અને પ્રાયોગિક દિવસની સવારે પ્રમાણિત નાસ્તો (1.5 g/kg શરીરનું વજન કાર્બોહાઇડ્રેટ) લેવામાં આવ્યો હતો. સ્થાનિક એનેસ્થેસિયા (એપિનેફ્રાઇન વિના 0.5 મિલી 1% લિડોકેઇન) હેઠળ, પર્ક્યુટેનીયસ બર્ગસ્ટ્રોમ એસ્પિરેશનનો ઉપયોગ કરીને વાસ્ટસ લેટરલિસ સ્નાયુમાંથી સ્નાયુ બાયોપ્સી મેળવવામાં આવી હતી.82 સ્નાયુના નમૂનાઓ તાત્કાલિક RNAlater માં એમ્બેડ કરવામાં આવ્યા હતા અને મેન્યુઅલ ફાઇબર ડિસેક્શન (3 દિવસ સુધી) સુધી 4°C પર સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યા હતા.
તાજા અલગ કરાયેલા માયોફાઇબર બંડલ્સને કલ્ચર ડીશમાં તાજા RNAlater માધ્યમમાં ટ્રાન્સફર કરવામાં આવ્યા હતા. ત્યારબાદ સ્ટીરિયોમાઇક્રોસ્કોપ અને બારીક ટ્વીઝરનો ઉપયોગ કરીને વ્યક્તિગત માયોફાઇબર્સને મેન્યુઅલી વિચ્છેદિત કરવામાં આવ્યા હતા. બાયોપ્સીના વિવિધ વિસ્તારોમાંથી રેસાઓ પસંદ કરવા પર ખાસ ધ્યાન આપીને, દરેક બાયોપ્સીમાંથી પચીસ રેસાઓનું વિચ્છેદન કરવામાં આવ્યું હતું. ડિસેક્શન પછી, દરેક રેસાને પ્રોટીનેઝ K અને DNase એન્ઝાઇમ ધરાવતા 3 μl લિસિસ બફર (સિંગલશોટ સેલ લિસિસ કીટ, બાયો-રેડ) માં નરમાશથી ડૂબાડવામાં આવ્યા હતા જેથી અનિચ્છનીય પ્રોટીન અને DNA દૂર કરી શકાય. સેલ લિસિસ અને પ્રોટીન/DNA દૂર કરવાની શરૂઆત પછી ટૂંકા વમળ દ્વારા કરવામાં આવી હતી, પ્રવાહીને માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજમાં સ્પિનિંગ કરીને અને ઓરડાના તાપમાને (10 મિનિટ) ઇન્ક્યુબેશન દ્વારા કરવામાં આવી હતી. ત્યારબાદ લાયસેટને થર્મલ સાયકલર (T100, બાયો-રેડ) માં 37°C પર 5 મિનિટ માટે, 75°C પર 5 મિનિટ માટે, અને પછી તરત જ -80°C પર વધુ પ્રક્રિયા થાય ત્યાં સુધી સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યું હતું.
ઇલુમિના-સુસંગત પોલિએડેનાઇલેટેડ આરએનએ લાઇબ્રેરીઓ ક્વોન્ટસેક-પૂલ 3′ mRNA-Seq લાઇબ્રેરી પ્રેપ કિટ (લેક્સોજેન) નો ઉપયોગ કરીને 2 µl માયોફાઇબર લાયસેટમાંથી તૈયાર કરવામાં આવી હતી. ઉત્પાદકના માર્ગદર્શિકામાં વિગતવાર પદ્ધતિઓ મળી શકે છે. પ્રક્રિયા રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન દ્વારા ફર્સ્ટ-સ્ટ્રેન્ડ cDNA સંશ્લેષણથી શરૂ થાય છે, જે દરમિયાન નમૂનાઓનું પૂલિંગ સુનિશ્ચિત કરવા અને ડાઉનસ્ટ્રીમ પ્રોસેસિંગ દરમિયાન તકનીકી પરિવર્તનશીલતા ઘટાડવા માટે અનન્ય મોલેક્યુલર આઇડેન્ટિફાયર (UMI) અને નમૂના-વિશિષ્ટ i1 બારકોડ રજૂ કરવામાં આવે છે. 96 માયોફાઇબરમાંથી cDNA પછી ચુંબકીય મણકા સાથે પૂલ અને શુદ્ધ કરવામાં આવે છે, ત્યારબાદ RNA દૂર કરવામાં આવે છે અને રેન્ડમ પ્રાઇમર્સનો ઉપયોગ કરીને સેકન્ડ-સ્ટ્રેન્ડ સંશ્લેષણ કરવામાં આવે છે. લાઇબ્રેરીને ચુંબકીય મણકાથી શુદ્ધ કરવામાં આવે છે, પૂલ-વિશિષ્ટ i5/i7 ટૅગ્સ ઉમેરવામાં આવે છે, અને PCR એમ્પ્લીફાઇડ કરવામાં આવે છે. અંતિમ શુદ્ધિકરણ પગલું ઇલુમિના-સુસંગત લાઇબ્રેરીઓ ઉત્પન્ન કરે છે. ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા નાના ફ્રેગમેન્ટ DNA વિશ્લેષણ કિટ (એજિલેન્ટ ટેક્નોલોજીસ, DNF-477-0500) નો ઉપયોગ કરીને દરેક લાઇબ્રેરી પૂલની ગુણવત્તાનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું.
ક્યુબિટ ક્વોન્ટિફિકેશનના આધારે, પૂલને સમતુલા સાંદ્રતા (2 nM) પર વધુ એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા. પરિણામી પૂલને પછી નોવાસેક 6000 ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટ પર સ્ટાન્ડર્ડ મોડમાં નોવાસેક S2 રીએજન્ટ કિટ (1 × 100 ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ) નો ઉપયોગ કરીને 2 nM લોડિંગ (4% PhiX) સાથે ક્રમ આપવામાં આવ્યો હતો.
અમારી પાઇપલાઇન લેક્સોજેનની ક્વોન્ટસેક પૂલ ડેટા વિશ્લેષણ પાઇપલાઇન (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis) પર આધારિત છે. i7/i5 ઇન્ડેક્સના આધારે ડેટાને પહેલા bcl2fastq2 (v2.20.0) સાથે ડિમલ્ટિપ્લેક્સ કરવામાં આવ્યો હતો. પછી i1 સેમ્પલ બારકોડના આધારે રીડ 2 ને idemux (v0.1.6) સાથે ડિમલ્ટિપ્લેક્સ કરવામાં આવ્યો હતો અને umi_tools (v1.0.1) સાથે UMI સિક્વન્સ કાઢવામાં આવ્યા હતા. ત્યારબાદ ટૂંકા રીડ (<20 લંબાઈ) અથવા ફક્ત એડેપ્ટર સિક્વન્સ ધરાવતા રીડને દૂર કરવા માટે રીડને બહુવિધ રાઉન્ડમાં કટએડેપ્ટ (v3.4) સાથે ટ્રિમ કરવામાં આવ્યા હતા. ત્યારબાદ STAR (v2.6.0c) નો ઉપયોગ કરીને રીડને માનવ જીનોમ સાથે ગોઠવવામાં આવ્યા હતા અને BAM ફાઇલોને SAMtools (v1.11) સાથે અનુક્રમિત કરવામાં આવી હતી. umi_tools (v1.0.1) નો ઉપયોગ કરીને ડુપ્લિકેટ રીડ દૂર કરવામાં આવ્યા હતા. અંતે, સબરીડ (v2.0.3) માં ફીચરકાઉન્ટ્સનો ઉપયોગ કરીને ગોઠવણી ગણતરી કરવામાં આવી હતી. પાઇપલાઇનના કેટલાક મધ્યવર્તી તબક્કાઓમાં FastQC (v0.11.9) નો ઉપયોગ કરીને ગુણવત્તા નિયંત્રણ કરવામાં આવ્યું હતું.
આગળની બધી બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ પ્રોસેસિંગ અને વિઝ્યુલાઇઝેશન R (v4.2.3) માં કરવામાં આવી હતી, મુખ્યત્વે Seurat (v4.4.0) વર્કફ્લોનો ઉપયોગ કરીને. 83 તેથી, વ્યક્તિગત UMI મૂલ્યો અને મેટાડેટા મેટ્રિસિસ Seurat ઑબ્જેક્ટ્સમાં રૂપાંતરિત કરવામાં આવ્યા હતા. બધા ફાઇબરના 30% કરતા ઓછા ભાગમાં વ્યક્ત થયેલા જનીનો દૂર કરવામાં આવ્યા હતા. 1000 UMI મૂલ્યો અને 1000 શોધાયેલ જનીનોના ન્યૂનતમ થ્રેશોલ્ડના આધારે ઓછી ગુણવત્તાવાળા નમૂનાઓ દૂર કરવામાં આવ્યા હતા. આખરે, 925 ફાઇબર બધા ગુણવત્તા નિયંત્રણ ફિલ્ટરિંગ પગલાં પસાર કરે છે. Seurat SCTransform v2 પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને UMI મૂલ્યોને સામાન્ય બનાવવામાં આવ્યા હતા, 84 માં તમામ 7418 શોધાયેલ સુવિધાઓનો સમાવેશ થાય છે, અને સહભાગીઓ વચ્ચેના તફાવતોને દૂર કરવામાં આવ્યા હતા. બધા સંબંધિત મેટાડેટા પૂરક ડેટાસેટ 28 માં મળી શકે છે.